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《吉林大学》 2004年
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重组人前列腺特异性抗原在毕赤酵母中的表达和活性测定

邹冬辉  
【摘要】:前列腺特异性抗原(prostate-specific antigen)由KLK3基因编码,KLK3基因位于19q13.2-q13.4,基因全长6KB,含有5个外显子和4个内含子,转录后的mRNA全长1446 bp,转录受雄激素调节。目前发现PSA在多种组织和体液中表达,精浆中的浓度最丰富,浓度可达0.5-2mg/ml,因为PSA具有丝氨酸蛋白酶和类胰凝乳酶活性,特异性降解精浆中的丝氨酸蛋白酶样和糜蛋白酶的特异性底物—semenogelins和fibronectin,液化精浆凝块,增加精子的活动力,而且PSA通过其激肽释放酶作用使精液中缓激肽或缓激肽样代谢物增加,缓激肽或缓激肽样物质能诱导平滑肌收缩,使精子活力增加,有利于受精。自1979年Chu及其同事揭示PSA与前列腺癌有相关性以来,学者们一直着重于PSA在前列腺癌的诊断、监控和预后评价的研究,虽然PSA与精浆的液化有关,但PSA的浓度和形式是否影响精浆的液化,从而在男性不育发病起一定因素,尚无进一步的研究。本教研室的前期工作发现,在少-弱精,液化不良,高黏度和高白细胞精液时PSA在精浆总蛋白中比例显著低于正常精液,其水平仅相当于正常精液的50%左右。我们认为PSA的浓度 WP=89 降低可能是精液状态异常的原因,为进一步探讨PSA在男性不育的诊断和体外改善精液质量的价值,本实验在毕赤酵母中表达具有活性的天然PSA。 实验中,首先从前列腺组织中提取总mRNA,逆转录获得人全长cDNA序列,PCR方法获得编码人PSA全长的cDNA序列,连入pGEM-T载体,命名为pGEM-PSA质粒,测序。正确后,重新设计带有酶切位点(Xhol I, Xbal I)和酵母Kex2 signal cleavage识别序列(AAAAGA)的引物,获得成熟PSA的cDNA序列,连入pGEM-T载体,命名为pGEM-mPSA质粒。双酶切pGEM-mPSA质粒和pPICZα-C质粒,将mPSA片段和载体大片段连接,构建表达载体,将其命名为pPICZα-mPSA。测序鉴定PSA基因正确插入酵母表达载体。PmeI酶切表达载体pPICZα-mPSA,线性化,电转转染X33感受态细胞,进行甲醇诱导表达,ELASA试剂盒检测表达水平,筛选出高表达rPSA的X33细胞株。用不同浓度的甲醇进行诱导表达,进一步摸索诱导表达的最适甲醇浓度。1.5%的甲醇浓度进行摇瓶培养,回收培养液,经Amicon超虑器进行超滤,阳离子交换层析纯化rPSA,经SDS-PAGE、Western-Blot鉴定PSA蛋白,应用S-2586检测rPSA酶活性。 通过以上工作,获得了PSA cDNA序列,且与gene bank一致。构建了pGEM-PSA质粒(含有PSA全长),pGEM-mPSA质粒(酶切位点和酵母识别位点)。在此基础上,构建了表达载体pPICZα-mPSA,并且成功整合进入酵母染色体,甲醇诱导成功表达出成熟人重组PSA。ELASA试剂盒筛选出高表达rPSA蛋白的X33细胞株,命名为X33#6。初步摸索了毕赤酵母的培养条件,发现诱导表达的最适甲醇浓度为1.5%。1.5%甲醇诱导培养,收集培养液上清,超滤浓缩,阳离子交换层析得到纯化的rPSA蛋白。经SDS-PAGE、Western Blot 鉴定表达的目的蛋 WP=90 白为人PSA,其产量约为1.2mg/L;在不同反应条件下,在3.5h内,酶活性与时间成正比;与正常精浆比较,rPSA活性显著高于正常精浆PSA酶活性。 本研究得出如下几点结论,本实验获得的酵母X33#6细胞株能够成功表达人前列腺特异性抗原,表达量为1.2mg/L;诱导表达的最适甲醇浓度为1.5%;阳离子交换层析方法可以纯化酵母表达产物rPSA;本实验获得的rPSA具有类胰凝乳酶活性,活性反应的最适温度为30℃;本实验获得的 rPSA的酶活性显著高于正常精浆的PSA酶活性。 本实验应用毕赤酵母表达有活性天然PSA,毕赤酵母作为简单的真核细胞,可以在简单的培养基中生存,费用低廉,由于PSA基因整合进入酵母染色体中,不需要在培养基中加入抗生素,可以进一步降低成本,适合工业化生产;我们采用的煮-冻-煮的方法破坏酵母细胞壁,获得酵母基因组DNA,经PCR鉴定,证实编码PSA成熟肽的基因整合进入酵母染色体。该方法较invitrogen公司推荐的酵母DNA提取方法简单,并且不用消解酶 Zymolyse,降低实验成本,而且通过这种方法可以大批量制备DNA模板,进行PCR鉴定,可大大加快筛选过程。有报道提出毕赤酵母的一个优点是,在适量甲醇浓度下,AOX1启动子调控细胞转录的水平比过量的甲醇高3-5倍,从而降低了甲醇代谢的耗氧量,减少了对外源蛋白表达的影响。我们采用不同浓度的甲醇进行诱导,发现1.5%甲醇浓度能够使表达量提前达到高峰,PSA蛋白亦不出现降解。依据PSA的等电点,我们选择了阳离子交换层析的方法纯化蛋白,通过Wester-Blot 证实纯化得到的蛋白为PSA蛋白。PSA具有类胰凝乳蛋白酶的活性,我们应用胰凝乳蛋白酶特异性底物S-2586检测rPSA是否具有酶活性,参考文献报道,我们采用了最佳的pH值,并在反应体系中加入能够增强PSA酶活性的物质,在21℃、30℃和37℃条件下,在3.5h WP=91 内rPSA的酶活性与时间成线性关系,表明rPSA具有类胰乳蛋白酶活性,并且我们发现最适的酶反应温度为30℃;与正常精浆做进一步比较,实验中得到的rPSA酶活性显著高于正常精浆PSA的酶活性。 通过本研究的初步摸索,应用毕赤酵母表达体系大规模生产rPSA将成为可能,进一步体外研究PSA的生物学特征、各种临床鉴测和治疗代谢奠定了
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R346

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