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含硒单链抗体和含硒十五肽模拟谷胱甘肽过氧化物酶

孙晔  
【摘要】:氧化应激(Oxidative Stress)是一种氧化和抗氧化的不平衡状态,当细胞内氧化代谢产物增加,或者细胞中抗氧化体系不能发挥作用时,就会使活性氧(ROS)产生堆积并对细胞产生毒性。近年来越来越多的研究表明,ROS参与许多生理及病理过程,在一些疾病的发生、发展过程中起着重要的作用,它具有高度的活性与极强的氧化反应能力,能通过氧化作用来攻击所遇到的任何分子,使机体内大分子物质产生过氧化变性、交联或断裂,从而引起细胞结构和功能的破坏,导致机体组织损害的器官退行性变化。 自由基清除剂分酶类清除剂(抗氧化酶)与非酶类清除剂两大类。酶类清除剂主要有超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX),它们构成了机体防止自由基损伤的主要防线。除酶类清除剂外,一些小分子物质也有很强的抗氧化作用,它们主要有维生素类(VC和VE)、Α-生育酚、抗坏血酸(VC)、还原型谷胱甘肽(GSH)、β-胡萝卜素、金属螯合剂、钙离子拮抗剂、黄酮类物质、多酚类物质和抗氧化肽等,这些小分子物质与抗氧化酶协同作用,使机体内的自由基处在一个有利于机体正常代谢的水平上。 WP=188 GPX是一种含硒蛋白质,尽管人们对其结构及硒的生物学作用等方面有了全面了解,但对它的作用机制还存在不同看法,而这方面的信息,一定程度上可从GPX的人工酶研究中获得,另一方面,GPX优良的抗氧化性,对治疗和预防克山病、心血管病、炎症及癌症等具有很大潜力。但由于该酶不稳定,来源有限,分子量大,易引起人体免疫反应等缺点,极大限制了此酶的开发和应用。因此,对此酶进行人工模拟,开发治疗上述疾病的药物越来越受到科学工作者的重视。 早期的GPX模拟物由于没有考虑到底物的结合作用,酶活力普遍很低,Ebselen就是其中一例,活力仅为0.99U/(mol。Wilson等人考虑到GSH的结合作用对酶活力的影响,在二硒键邻近处引入季胺盐,通过静电吸引增加对GSH结合,使所制备的GPX模拟物二苯基二硒化合物活力提高。Hilvert等人将枯草杆菌蛋白酶硒化为GPX模拟物,此硒化枯草杆菌蛋白酶对合适巯基底物3-羧基-4-硝基苯硫酚的催化效率为二苯二硒化合物的7(104倍,而对GPX天然底物GSH的活力却很低。这些结果充分说明模拟GPX要充分考虑产生GSH特异性结合部位,并提高对GSH的结合能力。含硒抗体酶的成功则在于充分考虑到产生GSH特异性结合部位对提高GPX活力的关键作用。但由于全抗分子量大,在作为药物开发方面具有不易运输及不易被机体细胞吸收等缺点。因此,我们从底物的特异性结合构建分子量较小的高活力GPX模拟物,并对其酶学性质和生物学效应进行研究,并通过人工模拟酶对细胞的作用,完成细胞水平上人工模拟酶在生物体内生物学效应的验证。 1.含硒单链抗体模拟GPX 我们运用单克隆抗体制备技术成功地制备了几种接近或超过天然GPX活力水平的单克隆含硒抗体酶,但由于全抗分子量大,不利于药物开发。因此构建了T7RNA聚合酶强启动子的单链抗体的表达载体pTMF-scFv,但由于表达形式为包涵体,且复性效率很低,给含硒单链抗 WP=189 体的制备带来很大困难,为了解决这一难题,我们室构建了单链抗体的可溶性表达载体pPelB-2F3,并得到高效表达的菌株Rose-2F3。本文通过正交实验筛选得到Rose-2F3表达可溶性单链抗体的最佳表达条件。使每升培养液中单链抗体的可溶性表达产物大约达到10mg。并经过两步法:离子交换层析和金属螯合亲和层析对可溶性单链抗体进行分离纯化,经过12% SDS-PAGE和Western Blotting验证,得到纯化的单链抗体。研究了甘油等化学伴侣对单链抗体可溶性表达产量的影响。利用化学突变将单链抗体活性部位的Ser的羟基转变为Sec,从而成功制备了具有GPX活力的SescFv2F3。其活力为12,000U/(mol,超过一些天然GPX活力,并高于经包涵体复性得到的单链抗体硒化后的SescFv2F3活力,是其活力的3.54倍。并对SescFv2F3的催化动力学进行了详细研究。其动力学表现出米氏动力学特征。反应初速度对底物浓度的双倒数作图呈平行线,表明SescFv2F3的催化机制为乒乓机制,与天然酶遵循相同的催化机制。 2.含硒多肽模拟GPX 使用噬菌体展示肽库技术获得一种能够识别GSH的短肽,根据“表面模拟”合成技术(Surface-simulation synthesis)的理论对短肽进行设计,并配合化学突变技术,从而获得一种新的具有GPX活力的肽酶15SeP,并通过HPLC-MS和硒氢基含量测定对其结构进行表征。按Wilson的酶偶联法进行活力测定,15SeP的活力达260U/(mol,相对于它的分子量来说,是目前已报道的具有最高活力的GXP模拟物。结构比较稳定,不同金属离子,如Ca2+、Cu2+、K+、Mg2+和Zn2+对15SeP的圆二色谱没有明显影响,对金属离子没有选择性。15SeP催化GSH还原H2O2的最适pH为8.94,最适温度为58.2℃。动力学分析表明,15SeP催化GSH还原H2O2的催化机制为乒乓机制,并且15SeP的kcat/KmH2O2 和 kcat/KmGSH均明显高于文献记载的其它GPX模拟物,达到和天然GPX一个数量级,对两个底物均具有很高的亲和力。这说明我们这个新制备的GPX模拟物具有非常可观的价值。经过动力学分析比较,15SeP对底物CuOOH具有比H2O2 WP=190 更强的亲


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