整合素αvβ3在细胞外基质调控人黑色素瘤MMP-2表达和活化中的作用

【摘要】：恶性黑色素瘤是一种恶性程度较高的肿瘤, 多好发于皮肤，易发生转移。黑色素瘤细胞在侵袭、转移过程中必须破坏由细胞间质和基底膜组成的细胞外基质(ECM)屏障。过去认为ECM仅仅起组织结构支架的作用及肿瘤转移的机械屏障作用，近年来随着ECM生物学研究的深入，许多新的ECM成份被分离、纯化、命名，对其功能也有了进一步的认识。ECM具有复杂而活跃的生物学功能，在胚胎发育、细胞粘附迁移、创伤修复及肿瘤浸润转移等生理和病理过程中发挥重要作用。而且可通过与肿瘤细胞表面的整合素分子相互作用，将细胞外微环境的信号传导到细胞内，从而调控肿瘤细胞的生物学行为，如形态改变，侵袭能力及各种酶类表达及活化的改变等。在肿瘤细胞穿过这些细胞外基质的过程中，基质金属蛋白酶发挥了重要作用。黑色素瘤细胞表达的MMP-2，MMP-9等是参与黑色瘤侵袭与转移的主要蛋白水解酶，尤其是MMP-2高表达的病人其预后较差，因此，MMP-2的激活是肿瘤侵袭的关键因素。MMP-2的活化是以一种膜依赖的方式进行的，在有少量TIMP-2存在的情况下，MT1-MMP对MMP2的活化大大增强，并推测TIMP-2的N末端与锚合于细胞膜表面的MT1-MMP活性区域相结合，共同作为MMP-2酶原的膜性受体，TIMP-2的C末端可与MMP-2酶原的C末端血红 WP=45 素结合蛋白区紧密结合，将MMP-2酶原拉近MT1-MMP，使其进一步被MT1-MMP水解、激活。 整合素是一类重要的细胞表面受体, 是由α亚基和β亚基以非共价键结合形成的跨膜异二聚体糖蛋白。其配体主要为ECM蛋白,如:胶原蛋白（Col lagen）、纤粘连蛋白(FN)、层粘连蛋白(LN)等,整合素通过识别这些细胞外基质蛋白介导细胞与ECM、细胞与细胞间的粘附反应并接受、传导级联信号以及调节细胞的生存、运动、增殖等生物学过程,在胚胎发育、肿瘤发生和侵袭转移、炎症、伤口愈合等过程中起了重要的作用。整合素不是单纯的粘附分子,在发挥粘附功能的同时还参与一种双向的信息传递过程:将信息从细胞外基质传递向细胞内部,同时细胞内部的事件也可以影响它们和配体之间的亲和性。它与ECM 中配体的连接可促使粘着斑的形成,如包被有ECM 的微珠能引起整合素交联,并引发多种FAP蛋白的聚集，进而引发一系列的信号传导，调节细胞生物学行为。 本实验以M21和M21-L这一对特殊的细胞系（M21-L是M21的缺陷型，既M21-L不表达整合素αVβ3）为研究对象，通过改变他们的细胞外微环境，即用ECM成分：Ⅰ型胶原、FN和ECM胶分别包被这一对细胞，从而诱导细胞生物学行为发生相应变化，如细胞形态的改变和黑色素瘤细胞所分泌的有关的基质金属蛋白酶的改变等，采用酶谱分析方法检测黑色素瘤细胞条件培养基中MMP-2在包被前后表达和活化情况，通过M21细胞与M21-L细胞这对细胞的唯一不同点，即M21-L细胞不表达整合素αVβ3，从而说明整合素αVβ3在细胞外微环境ECM成分（I型胶原、FN及 ECM胶）调控黑色素瘤细胞MMP-2的表达和活化中的作用和地位；因为整合素αVβ3是通过调控细胞内相关基因表达而发挥其调控作用的，我们为了进一步明确整合素αVβ3在MMP-2活化中的分子机制，应用RT-PCR检测了M21细胞与M21-L细胞在包被ECM成分前后MT1-MMP mRNA表达水平的变化。同时，为了明确 WP=46 整合素αVβ3在黑色素瘤细胞侵袭转移中的作用，我们进行了Boyden小室膜侵袭实验。 所得结果如下： 1、 直接培养于培养皿表面的人黑色素瘤细胞系M21稳定表达MMP-2 酶原；分别培养于三维聚合I型胶原、FN及 ECM胶（其成份包括层粘连蛋白、Ⅳ型胶原以及少量其它基质分子）的M21细胞，MMP-2酶原表达量增加，与空白对照组相比差异有统计学意义，P＜0.01。 2、 分别培养于三维聚合I型胶原、FN及 ECM胶（其成份包括层粘连蛋白、Ⅳ型胶原以及少量其它基质分子）的M21细胞所表达的MMP-2被活化，出现分子量为62KD的活性型MMP-2的水解带；空白对照组未出现活性型式的MMP-2。 3、 包被ECM前后的M21-L细胞均稳定表达MMP-2酶原；培养于三维聚合I型胶原、FN及 ECM胶的M21-L细胞系MMP-2酶原表达情况与包被前相比表达量增加，差异有统计学意义，P＜0.05，但未出现活化型式的MMP-2。 4、 体外培养的人M21细胞稳定表达MT1-MMP mRNA；但培养于三维聚合I型胶原组、FN组及ECM胶组的人M21细胞MT1-MMP mRNA表达明显高于对照组，与对照组间差异显著，P＜0.01。 5、 体外培养的M21-L细胞稳定表达MT1-MMP mRNA，但经包被后各组细胞间MT1-MMP mRNA的表达量无显著性差异(P＞0.05)。 6、 M21细胞组Boyden小室膜侵袭能力明显强于M21-L组，细胞数差异有统计学意义。 WP=47 上述结果提示： 1、 人黑色素瘤M21细胞和M21-L细胞均可稳定表达MMP-2酶原。 2、 人黑色素瘤M21细胞和M21-L细胞经三维聚合I型胶原、FN及 ECM胶包被后，只有M21细胞条件培养基中检测到活性形式的MMP-2，表明整合素αVβ3参与了M21细胞MMP-2活化过程，是ECM成分调控M21细胞MMP-2表达和活化的必要条件。 3、 ECM成分是通过整合素αVβ3将M21细胞外基质微环境的信号传导到细胞内，继而上调M21细胞MT1-MMP mRNA表达，启动MMP-2活化。 4、 整合素αVβ3的表达可以增强黑色素瘤细胞M21的侵袭能力。

【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R73-3