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《吉林大学》 2005年
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嗜热古细菌Pyrococcus horikoshii中蛋白酶的克隆、表达及酶学性质研究

张代辉  
【摘要】:Pyrococcus horikoshii 是从日本海分离的一种超嗜热古细菌,其最适生长温度为100 ℃左右,与生命的原初形态密切相关。而其所具有的蛋白酶类参与许多生物蛋白和肽类分解反应,是生物体代谢过程中必不可少的一类酶。本论文对来自于嗜热古细菌蛋白酶进行分子克隆,在大肠杆菌中表达了嗜热蛋白酶,并对其性质进行了基本研究。 我们根据遗传信息,通过生物信息学方法进行分析,确定研究古细菌Pyrococcus horikoshii 中的蛋白酶基因。从培养Pyrococcushorikoshii 古细菌出发,通过提取基因组DNA,设计PCR 引物,再经过PCR 反应,钓出PH 1704 基因,再将其插入表达质粒pET 21a,获得工程菌,大量培养后,通过超声,热变性获得了嗜热蛋白酶。经SDS-聚丙烯酰胺电泳,确定其蛋白单体分子量为18 kDa,聚体形式为二聚体、三聚体、六聚体等,通过同源GeneDoc 同源序列分析软件分析表明该酶和其他嗜热菌蛋白水解酶同源性较高,属于蛋白水解酶,结构为AlphaBeta 3-Layer(aba) Sandwich。 超嗜热蛋白酶PH 1704 的酶学性质研究表明,以Azogelatin 为底物时,该酶发挥催化活力最适温度为90 ℃,最适pH 为8.0,对表面活性剂SDS 表现部分抗性,在1 小时内,1-4%浓度的SDS 可部分提高嗜热蛋白酶的酶活;经1%SDS 处理4 小时后,酶活力依然保持80%左右。该酶还具有较强的热稳定性,重组酶溶液(2 mg/ml)在80 ℃的半衰期为10 小时,95 ℃半衰期为5 小时左右。
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:Q936

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