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狂犬病病毒糖蛋白哺乳动物细胞稳定表达细胞系建立及特性研究

于志凤  
【摘要】:本试验首先根据GenBank上所发表的狂犬病病毒CVS-24株糖蛋白基因序列,设计并合成一对特异性引物,通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),获得糖蛋白全长cDNA,测序证明克隆的正确性后,将其插入真核表达载体pIRES1neo,构建出糖蛋白单一表达载体pICG。同时还构建了绿色荧光蛋白和糖蛋白的融合表达载体pIEGFP-CG;表达质粒通过脂质体转染BHK-21细胞,在G418抗性压力下出现细胞克隆,通过PCR检测,确定启动子与糖蛋白基因在细胞基因组中共同整合。借助Western-blot检测,证明所表达的糖蛋白与狂犬病抗血清有特异的反应性;采用荧光观察和间接ELISA法,各筛选出三株高效表达糖蛋白的细胞株,扩大培养后,利用冻融的细胞悬液进行小鼠免疫试验,结果显示,随着免疫次数的增加,特异性抗体水平逐渐增加,三免后,六株表达糖蛋白的重组细胞免疫小鼠所产生的抗体均可中和60.25个TCID_(50)以上的狂犬病病毒。 在上述试验基础上,将狂犬病病毒接种于重组细胞当中,观察其复制增殖情况,结果发现,重组细胞在病毒感染后仍持续表达糖蛋白,表达量保持稳定,但病毒产量较正常BHK-21细胞有所下降,且表达量越高的重组细胞株产毒量越低。


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