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《吉林大学》 2006年
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利用蛋白质半理性设计提高超嗜热酯酶APE1547的活力

刘艳莉  
【摘要】:来源于古菌Aeropyrum pernix K1的酯酶\酰基氨酰肽酶(APE1547)具有超常的热稳定性和双酶活力(酯酶\肽酶)。本文应用半合理设计的方法提高了APE1547的酯酶活力。从本实验室已有的重组质粒pET11a/1547出发,利用易错PCR构建随机突变库。经过两轮连续的随机突变,得到了两株阳性突变体M010及M020。第一代突变体M010引入了R526S单点突变,其比活力提高为野生型的1.5倍。在此基础上的第二代突变体M020(R526S/E88G/A200T/I519)总活力较野生型提高了5.8倍,但比活力却与M010相近,进一步的表征发现其活力的提高是由于表达量较野生型提高了约4倍所导致的。 通过对突变体序列和结构分析,发现R526位点在酶发挥催化功能上具有重要的作用。所以我们选择526位点进行饱和突变,进一步研究它在催化中的功能。利用全质粒PCR方法构建526位点饱和突变库,通过筛选获得了一系列活性进一步提高的突变体,并且发现526位点的突变体对肽/酯两种底物的选择性发生了明显的改变。最终获得了突变体M030(E88G/A200T/I519/R526V)。与野生型相比催化效率提高5.8倍,蛋白表达量提高4倍,总活力提高了22.8倍,在90℃半衰期延长3倍,与野生型相比更加适合于工业生产中的应用。
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:Q814

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