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《吉林大学》 2007年
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布鲁氏菌种特异性抗原抗体免疫胶体金试纸条的研制及初步应用

唐景峰  
【摘要】: 将牛布鲁氏菌杂交瘤细胞株4B8、1C9、1G9、1E2和羊布鲁氏菌杂交瘤细胞株3C6、2D10、1E10扩大培养,制备单克隆抗体。纯化后抗体非特异带消失,抗体效价为1×106万以上,单抗亚型为IgG1、IgG3、IgG2a和IgG2b,亲和常数介于3.75×106~8.99×108,抗体IgG含量在1.6mg/mL~2.5mg/mL,纯度在95.4%~96.2%。用B.abortus 544A和B.melitensis 16M菌制备多克隆抗体。抗体纯化后SDS-PAGE显示,多抗片段大小与预期相符,羊、牛布鲁氏菌多抗效价分别为1:25600、1:51200,纯化后抗体蛋白含量分别为11.32 mg/mL和14.03mg/mL,IgG含量分别为10.45mg/mL和13.12mg/mL,且纯度达到92.3%和93.5%。采用胶体金免疫层析法,制备布鲁氏菌胶体金试纸,结果该试纸最低检测限为3×103~5×103CFU之间,与耶尔森菌O9、大肠杆菌O157、沙门氏菌和胸膜肺炎放线杆菌不发生交叉反应。模拟样本中水样的最低检测限为3×103CFU,土样、奶样为5×103CFU,且重复性好,4℃保质期为12个月。分别用热酚法和冷酚法提取B.abortus 544A和B.melitensis 16M菌的LPS,结果LPS的含量分别为1.21mg/mL、1.36mg/mL,经SDS-PAGE鉴定分子量分别为46000Da和59000Da,非特异带消失。利用纯化的LPS作为包被抗原,用重组金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)作为金标蛋白,组装成试纸。结果牛、羊布鲁氏菌抗体试纸最低检测蛋白量分别为1μg/mL、2μg/mL,不与大肠杆菌O157、小肠结肠炎耶尔森菌O9、沙门氏菌、胸膜肺炎放线菌的阳性血清交叉反应,4℃保质期为12个月。20份牛布鲁氏菌阳性血清用PBS1:1稀释之后,用本实验组装的试纸进行检测,结果19份为阳性,符合率为95%。18份牛布鲁氏菌样本血清经过处理以后,分别用平板凝集试验(PAT)和试纸进行检测。结果与PAT符合率为100%。
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:S854.43

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