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《吉林大学》 2007年
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人胰岛素样生长因子1(hIGF-1)中试工艺的研究

赵大鹏  
【摘要】: 本研究用改进的RT-PCR法合成人肝脏cDNA,构建出cDNA文库,并从中分离出人胰岛素样生长因子1(human insulin like growth factor 1,hIGF-1)基因。将hIGF-1基因酶切后插入到pGEX-1λT载体中,连接转化大肠杆菌NM522,筛选克隆,酶切鉴定后测序,并进行了表达。将IPTG诱导表达的菌体离心收集,取少量菌体进行SDS-PAGE分析,在分子量34KD处可见明显高表达带(对照菌没有表达),Western印迹表明重组蛋白具有hIGF-1的抗原性。 在完成以上研究的基础上,鉴于原核分泌型表达技术的优势,我们根据原核细胞分泌表达机制及需要,重新设计引物,利用PCR法分别分离出碱磷酸酶启动子(phoA),STII信号肽及hIGF-1编码基因,将它们连接到pUC载体,测序后,通过点突变技术对全基因序列进行了校正。 分别构建出两套分泌型表达载体,并将其命名为pCSA和pCST,随后将上述基因装入到pCSA和pCST中,转化大肠杆菌W3110,得到工程菌pCSA/IGF-1/W3110,pCST/IGF-1/W3110,并进行了表达。经SDS-PAGE检测,在分子量7.6KD处有明显高表达带,Western印迹表明重组蛋白具有hIGF-1的抗原性。 根据中国生物制品检定规程的有关要求,我们进行了基因工程大肠杆菌工程菌的筛选和鉴定,得到工程菌株pCSA/IGF-1/W3110 ,pCST/IGF-1/W3110,经传代培养,提质粒酶切鉴定及蛋白表达测定表明,经100次传代后质粒不丢失,酶切鉴定表明为阳性克隆,蛋白表达稳定。 根据中试工艺的要求,我们初步建立了分泌型hIGF-1的生产工艺,即为;种子液制备→发酵培养→离心收集菌体深度冷冻→rhIGF-1低渗震荡溶出→层析前处理→疏水层析→分子筛→离子交换→半成品。参照有关文献,以NIH3T3作为靶细胞,用XTT掺入法,初步建立了hIGF-1生物活性检定方法。
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:TQ464

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【参考文献】
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1 张绍昆,刘一,单玉兴,王刚,徐莘香;人胰岛素样生长因子-1稳定表达细胞株的构建及鉴定[J];吉林大学学报(医学版);2003年01期
2 徐伟文,吴岚晓,李明;胰岛素样生长因子-1的临床应用及其前景[J];国外医学(内分泌学分册);1999年06期
3 段宇;胰岛素样生长因子-1研究进展[J];国外医学.内分泌学分册;2001年06期
4 刘宝英;胰岛素样生长因子研究进展[J];国外医学(分子生物学分册);1996年03期
5 陈照丽;IGF系统的生物学功能及其与肿瘤的关系[J];国外医学(分子生物学分册);2003年01期
6 岳凤鸣,赵焕英,杨慧,高福禄,徐群渊;人胰岛素样生长因子-1基因的克隆、表达和活性检测[J];解剖学报;2003年03期
7 刘宝英,聂尚海,杜清友,丁红梅,刘农乐,王会信;人胰岛素样生长因子1突变体的构建、表达及其鉴定[J];军事医学科学院院刊;1999年02期
8 徐志伟,娄亚欣,李莹,邓鸿业,邓玉兰;人胰岛素样生长因子1的真核细胞表达及其鉴定[J];免疫学杂志;2001年01期
9 赵红,汪承亚,陈华群,丁小健,陈家伟;昆虫细胞表达重组人胰岛素样生长因子1的研究[J];南京医科大学学报;2000年04期
10 张应华;王小佳;;用于转化甘蓝的胰岛素样生长因子Ⅰ的合成及MAR调控的表达载体构建[J];农业生物技术学报;2004年06期
【共引文献】
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1 张岚;张轶清;;IGF-2、IGF-1R在早期宫颈癌中的表达及临床意义[J];安徽医学;2007年03期
2 陈运生;王德;孙玲玲;陈月生;赵维玲;马祖祥;;原发性肾病综合征患儿血清IGF-Ⅰ和血脂变化及相关性研究[J];蚌埠医学院学报;2006年04期
3 张绍昆,刘一,单玉兴,王刚,徐莘香;人胰岛素样生长因子-1稳定表达细胞株的构建及鉴定[J];吉林大学学报(医学版);2003年01期
4 张绍昆;谭岩;单玉兴;宋之明;徐莘香;;hIGF-1基因转染对成纤维细胞增殖的影响[J];吉林大学学报(医学版);2006年02期
5 付长峰;刘一;李相军;沈波;张绍昆;宋之明;张新;;IGF-1抑制SCI大鼠脊髓前角神经元凋亡的体内实验[J];吉林大学学报(医学版);2006年04期
6 孙文伟;魏丽琴;孙丽娟;侯杰;任磊;周雪艳;;胰岛素释放试验和胰岛素样生长因子-Ⅰ检测在2型糖尿病诊断和治疗中的应用[J];吉林大学学报(医学版);2011年03期
7 付秀美;王晓杰;钟美蓉;马洪伟;陈志宏;薛景凤;;中药治疗糖尿病机制研究进展[J];承德医学院学报;2009年04期
8 刘红云,童富淡;鱼类IGF-I生理功能及其表达调控的研究进展[J];水产科学;2004年05期
9 徐岩;贡成良;薛仁宇;沈卫德;曹广力;;人胰岛素样生长因子Ⅰ型在E.coli和家蚕中的表达[J];常熟理工学院学报;2006年04期
10 李兴华;杨华军;B.Roy;E.Y.Park;江丽军;王丹;缪云根;;RNA干扰技术和家蚕杆状病毒表达系统在纤维素酶研究中的应用前景[J];蚕桑通报;2009年02期
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1 欧阳建华;柳小春;施启顺;林树茂;孙汉;李海华;潘珂;;鸡胰岛素样生长因子-1基因的遗传多态性与部分蛋用性状的关系[A];家禽研究最新进展——第十一次全国家禽学术讨论会论文集[C];2003年
2 钱剑;刘国文;王哲;;铜对仔猪关节软骨细胞IGF-ⅠmRNA表达影响的实验研究[A];2003全国家畜内科学学术研讨会论文专辑[C];2003年
3 武艳平;霍俊宏;谢明贵;季华员;刘林秀;储怡士;唐伟国;宋琼莉;谢金防;;泰和乌鸡IGF-1基因多态性研究[A];中国家禽科学研究进展——第十四次全国家禽科学学术讨论会论文集[C];2009年
4 武艳平;谢金防;霍俊宏;刘林秀;谢明贵;季华员;储怡士;唐维国;;泰和丝羽乌骨鸡IGF-1基因与体重的关联分析[A];第二届中国黄羽肉鸡行业发展大会会刊[C];2010年
5 李光玉;杨福合;王凯英;郜玉钢;赵靖波;;梅花鹿、马鹿血清IGF-1及GH浓度年周期变化规律研究[A];增强自主创新能力促进吉林经济发展——启明杯·吉林省第四届科学技术学术年会论文集(上册)[C];2006年
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1 刘忠华;猪卵泡颗粒细胞凋亡及几种影响因素的研究[D];东北农业大学;2000年
2 屈纪富;合并全身放射损伤创伤局部成纤维细胞变化的机制与意义的研究[D];第三军医大学;2001年
3 段宇;胰岛素样生长因子-1基因表达及临床试验研究[D];南京医科大学;2002年
4 麻莉;内毒素结合肽EBP基因的克隆表达及其内毒素拮抗效应研究[D];第三军医大学;2003年
5 张皎;笼养蛋鸡骨质疏松的IP98防治机理及骨质疏松与IGF-Ⅰ的RFLP关系研究[D];南京农业大学;2004年
6 朱国强;IGF-1基因转染骨髓基质细胞应用于牙周组织工程的基础与动物实验研究[D];第四军医大学;2004年
7 董昌武;高血压病左室肥厚模型病证评价及滋水降火饮干预研究[D];北京中医药大学;2004年
8 唐志红;镭普克(rAPC)关键工艺的建立及抗肿瘤活性的研究[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2004年
9 孙维斌;秦川牛肉用性状及八个黄牛品种遗传关系的DNA分子标记研究[D];西北农林科技大学;2003年
10 何勇;p73基因在人肺癌中的表达及对其细胞生物学行为的影响[D];第三军医大学;2004年
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1 范忠玲;鸡白细胞介素18成熟蛋白在昆虫杆状病毒系统中的表达及其活性检测[D];山东农业大学;2010年
2 莫颖;2型糖尿病合并冠心病与踝肱指数的相关性分析[D];新疆医科大学;2010年
3 周鹏;某高校社区2型糖尿病患者生存质量现状及影响因素研究[D];安徽医科大学;2010年
4 汪明;稀土壳聚糖对鲫鱼非特异性免疫、肌肉品质及肠道微生物区系的影响[D];武汉工业学院;2010年
5 郭燕红;BL0033与BL0034在长双歧杆菌果糖ABC转运系统中功能的研究[D];江南大学;2010年
6 张利;二十二碳六烯酸对小鼠1型糖尿病的防治作用及机制探讨[D];吉林大学;2011年
7 徐强;Mmc LPPA基因的克隆、表达及对小鼠免疫效力研究[D];西南大学;2011年
8 李莉娜;2008年我国糖尿病疾病负担研究[D];北京中医药大学;2011年
9 张学维;塔里木马鹿茸基因鉴定及其冻干粉生物学活性研究[D];北京中医药大学;2011年
10 李潇;榄香烯联合热疗提高消化道肿瘤患者生活质量研究[D];北京中医药大学;2011年
【二级参考文献】
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1 杨亚东,李岱宗,杨和平,王贵春,张晨晖,周爱儒,汤健,马大龙;人VEGFcDNA的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达[J];北京医科大学学报;1994年S1期
2 唐震,周中华,徐晓刚;VEGF及IGF-1对Py-4-1细胞的增殖作用研究[J];第二军医大学学报;2002年08期
3 徐伟文,吴岚晓,李明;胰岛素样生长因子-1的临床应用及其前景[J];国外医学(内分泌学分册);1999年06期
4 韩学文;胰岛素样生长因子-Ⅰ的临床应用[J];国外医学.内分泌学分册;1995年02期
5 李春元;IGF系统在癌症中的作用和临床应用前景[J];世界临床药物;2003年09期
6 边兴艳;MTT比色法及其应用[J];国外医学(临床生物化学与检验学分册);1998年02期
7 项莹,张巾超,高萍,李强,孙予倩,成志锋;FIGF-Ⅰ、IGFBP-1与糖尿病酮症关系的研究[J];哈尔滨医科大学学报;2003年01期
8 王昕,黄秉仁,蔡良琬,王志学;用逆转录—聚合酶链反应法对类胰岛素生长因子cDNA的扩增[J];基础医学与临床;1991年01期
9 向军俭;陈彤;邹海燕;林剑;曾桂华;;重组碱性成纤维细胞生长因子生物活性检测方法的研究[J];暨南大学学报(自然科学与医学版);1993年01期
10 刘小青,李志英,林剑;MTT法检测Rh-bFGF提高Balb/c3T3细胞酶活性及促细胞增殖作用[J];暨南大学学报(自然科学与医学版);1998年05期
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1 林来兴妹,胡志明,孟晓静,黄树琪,王小宁;角质细胞生长因子-2的发酵及纯化工艺研究[J];中国生化药物杂志;2002年05期
2 朱永红,邹全明;非融合型重组人白细胞介素-18的纯化及鉴定[J];第三军医大学学报;2003年16期
3 徐娟;王柯;杨润琳;黄飚;段作营;李华钟;;人体中可溶性VEGFR-2酪氨酸激酶在大肠杆菌中的表达、纯化及活性测定[J];食品与生物技术学报;2011年03期
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6 吴铭;徐珍珍;王刚;孙旸;陈光;;重组人胶原蛋白肽的表达及纯化工艺的优化[J];湖北农业科学;2011年13期
7 谷新晰;许文涛;黄昆仑;罗云波;林希谨;陈卓君;田洪涛;;重组弹性蛋白酶诱导表达、纯化及酶学特性研究[J];食品科学;2009年19期
8 王威;盛清;;家蚕小热休克蛋白22.6基因的生物信息学分析及其原核表达[J];浙江理工大学学报;2010年04期
9 张仁怀,王海燕,谈宁馨,张风豪,张义正;豆豉溶栓酶基因在毕赤酵母中的表达及其产物的纯化[J];应用与环境生物学报;2005年05期
10 陈卫红;李多川;;嗜热子囊菌光孢变种β-葡萄糖苷酶的基因克隆、表达及酶学性质分析[J];应用与环境生物学报;2009年04期
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1 宫丽丽;方莲花;杜冠华;;重组人Rho激酶的表达纯化及其活性检测[A];中国药理学会第九次全国会员代表大会暨全国药理学术会议论文集[C];2007年
2 张锦秀;晁生玉;史利军;候绍华;李刚;;猪圆环病毒Ⅱ型修饰Cap蛋白基因的原核表达及纯化[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会论文集(上册)[C];2009年
3 温见翔;吴少庭;陈群;秦莉;袁仕善;雷明军;潘晖榕;林绮萍;张仁利;高世同;黄达娜;;结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的表达与纯化[A];中华医学会热带病与寄生虫学分会机会性感染学术研讨会论文汇编[C];2007年
4 温见翔;吴少庭;陈群;秦莉;袁仕善;林绮萍;雷明军;潘晖榕;张仁利;高世同;黄达娜;;结论分枝杆菌ESAT-6蛋白在pET原核表达系统中的表达与纯化[A];中华医学会热带病与寄生虫学分会机会性感染学术研讨会论文汇编[C];2007年
5 熊盛;钱垂文;黄立;刘秋英;张美英;王一飞;;50L规模中试发酵重组核苷二磷酸激酶A工程菌[A];提高全民科学素质、建设创新型国家——2006中国科协年会论文集[C];2006年
6 王志宇;王健伟;何深一;吴围屏;韩金祥;洪涛;;截短型A组轮状病毒VP6在E.coli中的高效表达[A];山东省药学会2006年生化与生物技术药物学术研讨会论文集[C];2006年
7 王晓艳;文刚;高玉龙;高宏雷;王笑梅;;鸡贫血病毒衣壳蛋白的表达纯化及多克隆抗体制备[A];提高全民科学素质、建设创新型国家——2006中国科协年会论文集[C];2006年
8 熊盛;钱垂文;黄立;刘秋英;张美英;王一飞;;50L规模中试发酵重组核苷二磷酸激酶A工程菌[A];2006年全国生化与生物技术药物学术年会论文集[C];2006年
9 阮冰;马亦林;陈勇;洪艳;;重组蛋白与合成肽抗原对戊型肝炎的诊断价值比较[A];2004年浙江省传染病、肝病学术会议论文汇编[C];2004年
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1 刘成刚 左朝胜;复能与罗氏携手人类重组蛋白研发[N];科技日报;2006年
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3 叶国标;为国家一级产业化项目找婆家[N];医药经济报;2001年
4 白毅;我国首获旋毛虫新基因[N];中国医药报;2005年
5 段炼炼叶颂涛;双鹭药业(002038) 进入高成长期可谓水到渠成[N];中国证券报;2007年
6 李宁 张磊 汤;基因工程新药的诞生将在制药业掀起一场革命[N];大众科技报;2006年
7 白毅;生物技术药物研发:百舸争流竞上游[N];中国医药报;2007年
8 王再阳 赵传玉 王朝霞;勇攀科技巅峰[N];科技日报;2003年
9 林一民;我研制出有机磷农药降解酶制剂[N];中国化工报;2006年
10 省农科院遗传所 高春燕 池惠荣 王朝江;牛粪也能遍开“双孢花”(上)[N];河北科技报;2006年
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1 孙红;抗ICAM-1单链抗体的制备及其生物学活性研究[D];吉林大学;2008年
2 张云华;灰葡萄孢菌激活蛋白的纯化、基因克隆与功能研究[D];沈阳农业大学;2008年
3 李强;放射状土壤杆菌M-503产生物絮凝剂的制备、纯化及应用研究[D];山东大学;2005年
4 徐境羚;马鹿精子膜蛋白纯化与理化性质分析[D];东北林业大学;2007年
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6 王敏炜;碳纳米管的制备及负载非晶态NiB合金的催化性能的研究[D];华南理工大学;2003年
7 陈静;嗜热毛壳菌热稳定糖化酶纯化及其编码基因的克隆与表达[D];山东农业大学;2006年
8 朱洁;乳酸链球菌素耐药菌株的筛选和耐药机理研究[D];浙江大学;2009年
9 于金刚;碳纳米管的化学修饰及对甲磺酸帕珠沙星的缓释研究[D];中南大学;2008年
10 惠明;枯草芽孢杆菌B53的分离鉴定及产聚γ-谷氨酸的研究[D];中国农业大学;2005年
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1 赵大鹏;人胰岛素样生长因子1(hIGF-1)中试工艺的研究[D];吉林大学;2007年
2 潘秦;重组人IL-2在毕赤酵母中的分泌表达及大规模发酵和纯化[D];吉林大学;2006年
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4 陈俊杰;重组人肝再生增强因子的表达和活性研究[D];沈阳药科大学;2007年
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6 徐蕾;结核分枝杆菌三种复活促进因子的原核表达和初步应用[D];重庆医科大学;2007年
7 康雪莲;人分泌磷蛋白2(SPP2)基因的克隆、原核表达与活性检测[D];西北大学;2010年
8 费敏;金黄色葡萄球菌RAP重组蛋白的高效表达及其在体内活性的检测[D];浙江大学;2006年
9 付灿;重组人成纤维细胞生长因子-8a(rhFGF8a)在大肠杆菌中的表达优化[D];广西师范大学;2006年
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