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RGD序列肽的合成、脂质体的制备及抗肿瘤作用的研究

侯瑞珍  
【摘要】: RGD三肽序列是细胞外基质及体内多种粘附蛋白分子所共有的细胞粘附和分子识别位点,是一类含有Arg,Gly和Asp三种氨基酸的小肽。RGD三肽及其衍生物在抗肿瘤、抗血栓、治疗急性肾衰、抗炎、治疗骨质疏松、皮肤再生及生物材料工程等方面的研究已有越来越多的报道。由于RGD具有广泛的应用前景,所以已经成为极具研究价值的生物活性肽之一。本论文主要围绕RGD肽的合成、制剂及生物活性方面进行了研究。 一、Alcalase酶催化下的RGD肽合成 本文以工业用碱性蛋白酶alcalase作为催化剂,在动力学控制下合成了RGD的前体三肽Bz-RGD-(-NH_2)-OH,RGDS的前体二肽Bz-Arg-Gly-NH_2和Z-Asp-Ser-NH_2。通过考察溶剂体系种类、水含量、pH值、温度、反应时间、底物摩尔比等因素对酶促肽合成产率的影响,得出最佳的反应条件。 Bz-RGD-(-NH_2)-OH合成是通过酶法和化学法相结合来完成的。这里所采用的化学法可以低成本、大规模地合成GD-(NH_2)_2。Bz-Arg-OEt和GD-(NH_2)_2之间的键合是通过酶法完成的。以alcalase为催化剂,Bz-Arg-OEt和GD-(NH_2)_2为底物,在水-有机溶剂双相体系中合成目标产物。合成该三肽的最佳反应条件是:Bz-Arg-OEt·HCl(0.05M),GD-(NH_2)_2(0.25M),三乙胺(35μl/ml体系),乙醇/0.1M Tirs-HCl pH 8.0缓冲液体系(85:15,V/V),35℃,反应时间8小时,产率达73.6%。 Bz-Arg-Gly-NH_2、Z-Asp-Ser-NH_2是合成RGDS的两个前体二肽,本文以alcalase为催化剂,分别以Bz-Arg-OEt·HCl、Z-Asp-OMe为酰基供体,以Gly-NH_2、Ser-NH_2为亲核试剂,在有机溶剂/水双相体系中合成目标产物。Bz-Arg-Gly-NH_2合成的最佳反应条件:Bz-Arg-OEt·HCl(0.05M),Gly-NH_2(0.35M),三乙胺(14μl/ml体系),乙腈/0.1M Na_2CO_3-NaH CO_3 pH10.0缓冲液(90:10,V/V),45℃,反应时间1小时,产率达82.9%。Z-Asp-Ser-NH_2合成的最佳反应条件:Z-Asp-OMe(0.05M)and Ser-NH_2(0.35M),三乙胺(28μl/ml体系),乙腈/0.1 M Na_2CO_3-NaHCO_3 pH 10.0缓冲液(90:10,V/V),35℃,反应时间6小时,产率达75.5%。 由上述结果我们可以得出如下结论:Alcalase酶在含有少量水的亲水性溶剂中(如乙醇、乙腈等)有很好的稳定性和催化活性,使亲水性小肽酶促合成可以在亲水性的溶剂中进行,解决了在亲水性小肽合成中需要兼顾底物溶解性和酶的活性及稳定性的问题。此外,从经济成本的角度出发,Alcalase是工业化酶,成本低,离心很容易沉淀下来,易于与产物分离并可以考虑重复使用的问题,适合规模化生产。尽管Alcalase酶目前还没有广泛用于肽合成中,但是它有望成为亲水性小肽合成中很有前景的催化剂。 二、木瓜蛋白酶催化下的RGD肽合成 本文研究了在纯水相体系中,碱性pH条件下,木瓜蛋白酶催化的Bz-RGD-OMe的合成,尽管在反应过程中合成的亲水性肽溶于反应体系中,但肽产物的二次水解不显著。最佳反应条件:Bz-RG(-OEt)和D(-OMe)_2·HCl分别为0.05M和0.15M,0.1M KCl/NaOH溶液作为反应介质(含有8mM EDTA和2mM DTT),pH8.5,40℃,反应时间为60min,最大转化率为62%。 上述结果进一步证实,对于木瓜蛋白酶来说,采用动力学控制,在pH>8时其水解酶的活性受到抑制,酯酶活性却很明显。在这个条件下能够合成出可溶性肽,并且不会发生二次水解。 三、RGD肽的化学法合成 本文根据RGD结构上有一个Gly这个特点,巧妙地设计了RGD合成的新路线。GD二肽合成采用了新颖的化学法,包括天冬氨酸的氯乙酰化和酰化产物的氨解。三肽的合成采用N-羧基内酸酐法,首先将苄氧羰酰精氨酸用催化剂催化使生成N-羧基内酸酐精氨酸,然后与游离的GD二肽缩合生成RGD三肽。这一路线中采用了较少保护的氨基酸,路线低成本、简单、快速,产率为62%。 四、脂质体制备 本文采用逆相蒸发法制备了RGD脂质体,在制备过程中对各种影响因素进行了考察,采用正交实验进行优化,确定最佳的工艺条件:即卵磷脂/胆固醇比例为5:1,RGD 16mg,PBS 8ml,超声时间5min。制得的脂质体平均粒径为473nm。包封率62.99%。稳定性实验证明RGD脂质体在4℃低温存放时较稳定,温度升高稳定性下降。随时间的延长包封率有下降的趋势。尤其是超过两个月包封率急剧下降。体外释放度实验证明RGD脂质体有一定的缓释效果。 五、RGD抗肿瘤作用 本文对上述化学法合成RGD肽进行了活性检测,细胞增殖实验、细胞粘附实验、细胞迁移实验证明:RGD肽对人纤维肉瘤细胞HT1080、人小细胞肺癌细胞NCI-H446、人肝癌细胞SMMC-7721增殖、在FN上粘附及迁移有一定的抑制作用。


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