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《吉林大学》 2007年
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沙蚕纤溶蛋白酶的生化与分子生物学研究

张云龙  
【摘要】: 血栓栓塞性疾病(thrombotic disease, TD)已成为目前严重的医学问题,发病率、致残率、致死率皆高。药物溶栓是目前临床应用最广泛、最有效的治疗手段。迄今为止,溶栓剂已发展了三代,但依然存在一定的缺陷,有待开发出一种安全有效的新型溶栓剂。本研究旨在从中国渤海湾海洋环节动物沙蚕(Nereis virens)体内开发出一种新型的海洋生物溶栓剂,确定其分子特征、酶学特性及溶栓机制,并构建此生物cDNA表达型文库筛选其克隆基因,为进一步分子生物学方面的深入研究奠定基础。 本研究成功地从中国渤海湾沙蚕(Nereis virens)体内发现并提纯出一种电泳纯的新型海洋纤溶活性成分——沙蚕纤溶酶,又名N-V蛋白酶,并明确其主要富集于沙蚕(Nereis virens)的体腔液和内脏组织中。此酶的纯化工艺非常稳定,每升组织粗提液约可获得0.2mg活性蛋白,回收率为28.9%。该酶及其纯化工艺已获取国家发明专利(沙蚕蛋白酶及其分离提取纯化方法和应用,申请号:02144828.0,公开号:CN 1500873A)。证实此酶为一种单链蛋白,属丝氨酸蛋白酶家族新成员,具有类胰蛋白酶特性,表观分子量为29,000Da,等电点为4.5。经专一性水解酶降解,MALDI-TOF质谱分析,获取酶分子中10段多肽链的N-端氨基酸序列,Swiss-Prot数据库申请登录号为P83433,经分析比对,证实此酶为一种新发现的蛋白酶。 该酶的纤溶活力和体外溶栓效果明显,比活力达116280U/mg,且具有良好的热稳定性和pH稳定性。溶栓机制分析发现,该酶为一种类尿激酶作用位点的纤溶酶,并发现与蚓激酶相似,既具有直接纤溶活性,也具有激酶活性,即通过激活纤溶酶原,使其转化为纤溶酶的间接纤溶活性。其能高特异性水解纤维蛋白原的Aα-链,而对Bβ-和γ-链的水解活性较低(AαBβγ),且能有效地水解纤维蛋白的α-链,而对β-和γ-γ链的水解活性较低(αβγ-γ),并经胶内蛋白酶水解活性实验证实此蛋白水解活性与29,000Da电泳蛋白带相关。此外,还成功构建了沙蚕(Nereis virens)虫体的完整性cDNA表达型文库,为进一步基因克隆和表达研究奠定了良好基础。
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R91

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【引证文献】
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【参考文献】
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【共引文献】
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【同被引文献】
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【二级参考文献】
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