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《吉林大学》 2007年
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犬副流感病毒进化分析及核酸疫苗和犬腺病毒重组疫苗的研究

闫喜军  
【摘要】: 犬传染性呼吸系统疾病(CIRD),即犬窝咳,临床特征表现为发热、咳嗽、流涕,是一种多因素和多种病毒、细菌引起犬的重要疾病,其中犬副流感病毒(CPIV)是CIRD主要病因。血清学调查表明该病在世界各国普遍存在,是危害犬业重要传染病之一。为了解我国犬副流感病毒流行情况,采用血凝抑制试验和血清中和试验进行了东北三省部分地区犬群中犬副流感病毒血清学调查,结果表明犬群中CPIV阳性率为35~52.83%。采用建立的CPIV的RT-PCR检测方法,对收集的20份样品进行检测,检出1份阳性样品。通过分析GenBank中发表的SV5核苷酸序列并设计引物,经RT-PCR分别扩增获得了CPIV FA和FC株的H、F和N基因,通过与副流感病毒相关序列进行比较分析,结果表明CPIV FA株、CPIV FC株的N基因序列与猴SV 5的N基因同源性为99.5%,而与CPIV T65克隆中的N基因同源性分别为98.7%和98.6%,而与人的1、3、4型副流感病毒同源关系较远; FA、FC株H基因与发布的BD280413的H基因同源性达99.8%和99.9%,同源性较高。与GenBank中的20株不同来源的副流感病毒F基因进行分析,结果表明FA株与猪副流感SER株F基因同源性最高,达99.8%;FA、FC株与BD280413和AX067835F基因同源性分别为99.5%和99.6%,属于同一分支。与SV5不同毒株的F基因同源性在97.8%~98.3%之间,核苷酸变化为0.02%~2.2%; F基因系统发生结果表明CPIV F基因相对比较保守。对CPIV FA、FC株F蛋白进行分析表明,两株病毒与猪副流感SER株F蛋白有极大的相似性,仅FA株在160位、457位发生氨基酸改变, FC株在22位、370位与SER株相比有两个氨基酸的变异。说明FA、FC株与SER株属于同一分支。研究还发现,FA株与新疆报道CPIV F蛋白比较有9个位置发生氨基酸改变;与78524、H221两个SV5病毒株存在10个氨基酸位点不同;氨基酸变异为0.36%~2.9%。 将CPIV H和F基因分别克隆入真核表达载体pVAX1和pCI的CMV启动子下游,构建了CPIV基因疫苗表达载体pVAX-H、pVAX-F和pCI-H、pCI-F。利用脂质体分别将表达载体pVAX-H、pVAX-F转染DK细胞进行瞬时表达,并采用间接ELISA和免疫印迹试验进行表达产物测定,表明犬副流感病毒H、F基因得到成功表达,并且具有较好的免疫原性。以构建的真核表达载体pVAX-F、pVAX-H和pCI-H、pCI-F为基因疫苗,分组进行了小鼠和犬免疫试验,通过血清中和抗体检测、淋巴细胞转化试验及T淋巴细胞亚类检测结果表明:pVAX-F、pVAX-H和pCI-H、pCI-F均可诱导小鼠产生CPIV特异的免疫应答反应。双基因混合免疫小鼠诱导产生了较强的体液免疫和细胞免疫应答。基因疫苗也诱导犬产生体液免疫和细胞免疫应答。测定CpG对基因疫苗的免疫佐剂作用,结果血清中和抗体差异不明显,但CpG组淋巴细胞增殖幅度高于对照组。在基因疫苗研究的基础上,以犬2型腺病毒全基因组质粒pPoly2-CAV-2为载体,转移质粒pVAXΔE3为中间载体,将CPIV F基因表达盒定向克隆入pPoly2-CAV-2质粒中,构建E3区部分缺失的包含CPIV F基因表达盒的犬2型腺病毒重组质粒pCAV-2/CPIV-F。利用脂质体将构建的重组病毒基因组转染DK细胞获得了重组病毒CAV-2/CPIV-F。通过电镜检查、PCR、重组病毒基因组酶切图谱分析,证实构建了表达犬副流感病毒F基因的犬腺病毒重组疫苗。经PCR和Western-blot检测,表达蛋白具有免疫活性。重组病毒CAV-2/CPIV-F免疫犬,诱导犬产生了特异的抗CAV-2 HI抗体和抗CPIV中和抗体,中和抗体效价为1:5.6~1:16。重组病毒体外传31代,仍具有良好的遗传稳定性。本研究为CPIV基因疫苗和重组活病毒载体疫苗的研制奠定了基础。
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:S852.5

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