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牛蛙皮肤抗菌肽分离纯化、基因克隆表达及生物学特性的研究

韩俊友  
【摘要】: 本研究以牛蛙(Rana catesbiana)、猪蛙(Rana grylio)、中国林蛙(Rana temporaria chensinensis)和东北林蛙(Rana dybowskii Gurnther)为实验材料,通过两种诱导和提取方法获得这四种蛙的皮肤分泌液和皮肤粗提物,进行了一系列的生物活性测定,结果表明,在所测定的活性中,不同种类的蛙皮肤粗提物活性并不相同,不同方法诱导和提取的同一种蛙类的活性也有差异。通过Sephadex G-50凝胶过滤和反相高效液相色谱(RP-HPLC),对牛蛙皮肤分泌液和皮肤粗提物进行了分离纯化。并对有抑菌活性的峰进行了质谱分析。应用SMART (switching methanism at 5′-end of RNA Transcript)技术,以λTripIEx2为载体构建了牛蛙皮肤cDNA文库,构建的文库原始库容量为1.42×106 pfu/mL,插入片段长度在0.5~1.5kb ,重组率为89.5%,扩增后的文库滴度为1.35×109 pfu/mL。根据同源性相近的两栖类设计引物, RT-PCR的cDNA为模板,克隆到大小为372bp的片段目的片段RCABP,构建融合表达质粒pQE-80L/DHFR/RCABP,经优化实验,确定最佳诱导表达条件为终浓度1 mmol/L的IPTG在37℃、pH值7.2条件下诱导表达4h。SDS-PAGE进行检测,表达量平均占菌体总蛋白的31.7%,以包涵体的形式存在。琼脂扩散实验表明在大肠杆菌中表达的蛙皮抗菌肽具有体外抑菌活性。以纯化牛蛙蛙皮抗菌肽蛋白为抗原免疫獭兔,制备抗牛蛙抗菌肽蛋白的多克隆抗体,经ELISA法测定抗体效价为1:6400,经亲和层析纯化,Western blot分析制备抗体与原核细胞表达的牛蛙皮肤抗菌肽可以发生特异性结合反应。本研究为抗菌肽的理论研究和大量生产奠定了基础。


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