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食物中毒菌多联融合毒素免疫学检测方法的建立

李兆辉  
【摘要】: 本实验以常见食物中毒菌金黄色葡萄球菌、O157:H7大肠杆菌和肉毒梭菌3种细菌的5个毒素基因的融合毒素基因工程菌T2为模板,扩大培养,用1mmol/L IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,结果显示,37℃,5 h时表达量最高,融合毒素基因工程菌T2在66-97 kDa之间出现了明显的表达带,其大小与预测分子量(88.899 kDa)相当,经薄层扫描表达外源蛋白量占全菌体蛋白总量的20.44%,表达蛋白大部分以包涵体(17.60%)形式存在,少量为可溶性蛋白(2.84%)。用纯化后的包涵体免疫獭兔制备血清抗体。经ELISA检测,血清抗体对不同毒素抗原的效价不同。经Western-blotting试验表明,融合毒素具有良好的反应原性。 建立了检测食物中毒菌间接ELISA操作程序,并对ELISA的反应条件进行了优化。用免疫获得的血清抗体与5种天然毒素抗原进行免疫学反应,ELISA检测,结果表明,5种天然毒素均呈明显的阳性反应,用27种非目标菌与血清抗体进行特异性反应实验,未见明显的阳性反应。对VT1、VT2、SEA、SEB、BoNTa五种天然毒素的检测敏感度分别为3.75 ng/mL,7.5 ng/mL,31.25 ng/mL,15.6 ng/mL,15.6 ng/mL。 利用柠檬酸三钠还原法制备了胶体金颗粒,采用胶体金免疫层析法,用纯化的血清抗体为金标抗体,用纯化的融合毒素包涵体蛋白为包被抗原,以羊抗兔IgG-HRP为质控线,制备胶体金试纸。该试纸条对VT1、VT2、SEA、SEB、BoNTa五种天然毒素的最低检测限为2μg/mL、4μg/mL、4μg/mL、4μg/mL、8μg/mL。胶体金免疫检测试纸条具有较好的特异性,与李氏杆菌等27种细菌不发生反应,4℃保质期为6周。


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