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胸腺五肽的化学—酶法合成及其脂质体缓释剂型研究

李世军  
【摘要】: 胸腺五肽(TP-5)是人工合成的五肽(Arg-Lys-Asp-Val-Tyr)对应胸腺生成素的32至36位氨基酸,具有天然胸腺生成素的全部生物活性。它具有多种功能,可以诱导多种激素的分泌,介导早期T细胞分化和免疫调控并增强分化的T细胞的功能等。研究表明胸腺五肽在治疗类风湿性关节炎,变应性皮炎,异位性湿疹,以及某些生殖系统感染和放化疗辅助治疗方面都显示出疗效。胸腺五肽也可用于肿瘤的治疗或辅助治疗,胸腺五肽具有调节免疫系统使其正常化的特性,它对免疫超强和免疫缺陷引发的疾病均有作用。还有研究表明TP-5可以治疗有毒瘾的人的淋巴结病,抑制人体细胞内超氧化物的积累,对胰岛素依赖型糖尿病有缓和作用。当胸腺本身功能不足或依赖胸腺的免疫系统出现明显的原发性或继发性缺陷,而自身的调节又不足以修复时,给予外源性胸腺激素就可以产生明显的疗效。如果机体免疫系统功能紊乱、低下或亢进,外源性胸腺激素可产生明显的双向调节作用。由于TP-5具有广泛的应用前景,所以已经成为极具研究价值的生物活性肽之一。本论文主要围绕TP-5肽的酶法和化学法的合成及制剂方面进行了研究。 一酶法合成TP-5前体二肽Bz-Arg-Lys-NH2和Z-Asp-Val-NH2 1前体二肽Bz-Arg-Lys-NH2的合成 本研究采用酶法在动力学控制下合成了胸腺五肽前体二肽Bz-Arg-Lys-NH2。分别以工业用碱性蛋白酶Alcalase和胰酶为催化剂,以Bz-Arg-OEt?HCl为酰基供体,以Lys-NH2为亲核试剂,在有机溶剂/水双相体系中合成目标产物。并考察了影响肽合成产率的因素,对有机溶剂种类、含水量、pH值、反应温度、反应时间、底物摩尔比等进行条件优化,确定了Bz-Arg-Lys-NH2二肽合成的最佳反应条件。应用工业用碱性蛋白酶Alcalase为催化剂,在乙腈/DMF/ Na2CO3-NaHCO3 (80:10:10, V/V)体系中,反应6小时达到最大产率71.1%。研究证明Alcalase酶在此体系中保持催化活性,并且非常稳定。应用胰蛋白酶为催化剂,在乙醇/ Tris-HCl (80:20, V/V)体系中,反应4小时达到最大产率76.1%。并且建立了利用Sephadex G-10柱层析的简便有效的分离纯化方法,采用高压液相色谱(HPLC)法和质谱(MS)法鉴定目标产物的纯度和分子量。 2前体二肽Z-Asp-Val-NH2的合成 本研究采用Alcalase催化,动力学控制下合成了TP-5前体二肽Z-Asp-Val-NH2。以工业用碱性蛋白酶Alcalase为催化剂,以Z-Asp-OMe为酰基供体,以Val-NH2为亲核试剂,在有机溶剂/水双相体系中合成目标产物。并考察了影响肽合成产率的因素,对有机溶剂种类、含水量、pH值、反应温度、反应时间、底物摩尔比等进行条件优化,建立了最佳反应模型。反应5小时,前体二肽Z-Asp-Val-NH2最大产率达到63.0%。 二化学法-酶法合成TP-5前体三肽Z-Asp-Val-Tyr-OH 本研究采用酶法和化学法相结合的技术合成了胸腺五肽前体三肽Z-Asp-Val-Tyr-OH。首先,采用一种新颖的化学法合成了Val-Tyr-OH,反应分两步进行,首先制备NCA-Val,然后在乙腈与Na2CO3-NaOH缓冲液组成的双相体系中合成Val-Tyr-OH,这个方法具有高收率、低成本、合成规模大等特点。并探讨了有机溶剂,搅拌速度,反应温度,pH,反应时间,底物比例,酸化pH等各种因素对二肽合成产率的影响,找到了合成Val-Tyr-OH的最佳条件。在最佳条件下,目标产物的产率为91.36%。 然后以Z-Asp-OMe为酰基供体,以Val-Tyr-OH为亲核试剂,以alcalase酶为催化剂,采用动力学控制的方式在水-有机溶剂双相体系中合成目标产物。我们考察了有机溶剂、水含量、温度、pH值和反应时间等因素对肽合成产率的影响,确定了Z-Asp-Val-Tyr-OH三肽合成的最佳反应条件。在最佳反应条件下,反应时间2.5小时,Z-Asp-Val-Tyr-OH产率达71.3%。 三胸腺五肽的化学合成 本研究采用固相合成法合成了胸腺五肽Arg-Lys-Asp-Val-Tyr。用羟基树脂(HMP)作载体,将Fmoc-Tyr(OBut)-OH连接到树脂上,然后依次连接Fmoc-Val-OH,Fmoc-Asp(OBut)-OH,Fmoc-Lys(Bos)-OH,Fmoc-Arg(Mtr) -OH,最后用TFA切落肽段。用固相法合成胸腺五肽,收率为30%。此外,还用液相法合成了胸腺五肽前体三肽Z-Lys(Boc)-CONH-Asp-(OEt)2。四胸腺五肽脂质体制备及其表征 本文采用逆相蒸发法制备了TP-5脂质体,在制备过程中对各种影响因素进行了考察,采用正交实验进行优化,确定最佳的工艺条件:卵磷脂/胆固醇比例为5:1 ,PBS 10ml胸腺五肽15 mg,超声时间5 min。得到胸腺五肽脂质体包封率为58.21%,平均粒径340nm。稳定性实验证明TP-5脂质体在4℃低温存放时较稳定,温度升高稳定性下降。随时间的延长包封率有下降的趋势。


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