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《吉林大学》 2008年
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血小板无力症分子发病机制和玉足海参糖胺聚糖抗血栓形成机制的研究

沈卫章  
【摘要】: 本文根据临床表现、家系资料、实验室检查确定了4个血小板无力症先证者的临床表型诊断和分型;应用PCR法对先证者αⅡb和β3基因所有外显子及其侧翼序列进行扩增;产物纯化或T-A克隆后直接测序。突变位点经等位基因特异PCR或直接测序排除基因多态性。采用PCR定点突变的方法构建αⅡb P126H、L721R和Q860X突变真核表达载体,分别与表达β3的真核表达载体共转染293T和CHO细胞。采用流式细胞术检测细胞膜上αⅡbβ3的表达,用Western印迹法鉴定αⅡbP126H、L721R和Q860X突变体在细胞内的总体表达,采用免疫荧光共聚焦显微镜确定αⅡbP126H、L721R和Q860X突变体的细胞内定位。结果显示:对4个先证者进行基因分析发现6种αⅡb基因突变,包括C1750T(R584X),69-79del,A2334C(Q747P),T2255G(L721R),C2671T(Q860X),C470A(P126H)突变,其中P126H、L721R、Q860X、69-79del为国际首次报道。P126H、L721R突变体转染的细胞表面几乎检测不到αⅡb,Q860X突变体转染的细胞αⅡb表达率明显减低。αⅡbP126H、L721R与B3共表达后,可检测到前体αⅡb,未检测出成熟αⅡb。αⅡbQ860X与B3共表达后,检测到分子量减低的截短型αⅡb蛋白。P126H、L721R和Q860X突变αⅡb蛋白主要分布于内质网,仅有少量进入高尔基体中。三种突变阻碍了pro-αⅡbβ3复合物由内质网向高尔基体的转运,导致细胞内滞留,L721R突变可能对Q860X突变的αⅡbβ3复合物的表达有显性抑制作用,初步阐明了P126H、L721R和Q860X突变导致血小板无力症的分子机制。 不同浓度的玉足海参糖胺聚糖(GAG)与人血管内皮细胞株EA.hy926共孵育或相同浓度GAG与EA.hy926细胞孵育不同的时间,检测细胞培养上清中游离组织因子途径抑制物(TFPI)的抗原含量和活性水平:定量测定EA.hy926细胞内TFPI mRNA水平;观察细胞内、表面TFPI荧光强度的变化。采用凝血酶、组织型纤溶酶原激活物(t-PA)、氯化钙建立正常人混合血浆的体外凝块溶解实验,分别加入不同浓度的GAG和/或凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)特异的抑制剂羧基肽酶抑制物(CPI),观察凝块的凝固和溶解时间,以及TAFI相关的凝块溶解延滞(TRR)时间。结果显示:GAG以浓度和时间依赖的方式促进血管内皮细胞TFPI的合成、表达和分泌;GAG以浓度依赖的方式缩短TRR,抑制TAFI功能促进血栓的溶解。上述研究进一步阐明了GAG抗血栓形成的作用机制。
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R55

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【参考文献】
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