牛蛙（Rana catesbeiana）皮肤活性肽的分子克隆及其生物学活性研究

【摘要】： 本研究以牛蛙(Rana catesbeiana)皮肤中提取的mRNA为材料,构建牛蛙皮肤cDNA文库。根据GenBank已报道蛙属抗菌肽基因信号肽保守区域设计简并引物,利用PCR方法对文库进行筛选。结果得到48个完整的cDNA序列,分别编码24种抗菌肽前体,属于9个不同的抗菌肽家族。其中18个分别属于已知的Ranatuerin-1(6个)、Ranatuerin-2(3个)、Temporin(3个)、Palustrin(1个)、Ranatuerin-5(3个)、Ranatuerin-7(1个)、Ranatuerin-8(1个)家族,6个与已发现的抗菌肽同源性较低,为新发现的抗菌肽序列,根据序列特征分析结果将其归为以下3个家族: Catesbeianin-1 ( Catesbeianin-1 ); Ranacyclin(Ranacyclin-Ca、Ranacyclin-Cb与Ranacyclin-Cc);Temporin(Temporin-La、Temporin-Lb)。 对新发现的抗菌肽进行化学合成,通过生物学活性比较研究,得到了抗菌肽、胰蛋白酶抑制剂和凝集素三种生物活性肽。其中包括两个同时具有抗菌活性与胰蛋白酶抑制剂活性的多肽Ranacyclin-Ca与Ranacyclin-Cb,测定其对胰蛋白酶的抑制常数分别为7.02×10~7M与5.6×10~7M,为不可逆抑制并具有热稳定性。凝集素活性测定筛选到分子量为1471.8Da的牛蛙凝集素Temporin-1Ca,并利用激光共聚焦显微镜观察了凝集素Temporin-1Ca对金黄色葡萄球菌、猪链球菌2型、胸膜肺炎放线杆菌、仔猪副伤寒沙门菌的凝集活性。Temporin-Lb与Catesbeianin-1具有很强的DPPH自由基清除能力;Palustrin-Ca能够促进NO释放,当浓度为10μg/mL时,可以促进57.45%的NO释放。抗肿瘤细胞活性测定结果,Temporin-La对胃癌细胞株SMMC7721的IC_(50)为1.384μg/mL,而Palustrin-Ca对肝癌细胞株SGC7901的IC_(50)仅为0.951μg/ mL。抗SIV测定结果表明,在CEMX174细胞最大安全浓度下,Palustrin-Ca和Catesbeianin-1对SIV的抑制率较高,可达88.79%与84.30%。 通过随机筛选牛蛙皮肤cDNA文库,从牛蛙皮肤中得到牛蛙缓激肽Kininogen-1Ca的前体及cDNA序列,编码RR9(RPPGCNPFR)和RL16(RPPGCNPFRIAPASYL)的牛蛙缓激肽。结果显示具有明显的促进大鼠回肠肌收缩的作用。这是首次从牛蛙中得到的缓激肽类分子及其cDNA序列。 应用透射电镜对筛选到的4种牛蛙抗菌肽的抗菌机制进行了初步研究,并观察了牛蛙抗菌肽对金葡菌感染小鼠创面的治疗效果,结果表明合成的牛蛙抗菌肽Palustrin-Ca和Temporin-La对小鼠金葡萄感染创面有明显的抗感染作用并能促进创面的愈合。本研究为牛蛙皮肤抗菌活性肽的多样性提供了依据,同时也为研究多样性的两栖动物皮肤活性肽,发现新型抗菌、抗癌药物前体物质,设计新型活性肽建立了研究方法和参考。