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《吉林大学》 2009年
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RNAi沉默Med19基因对人肺癌A549细胞生长、转移影响的实验研究

李金东  
【摘要】： 目的:探讨应用RNAi技术沉默Med19基因抑制人肺癌A549细胞生长、转移的效果。 方法:①以Med19己知序列为靶点,构建siRNA-Med19重组慢病毒载体。②siRNA-Med19慢病毒表达载体与pCDNA3.1(-)- Med19过表达载体共转染293T细胞,Western blot外源筛选靶点。③将siRNA-Med19慢病毒表达载体转染人肺癌A549细胞株,应用Real-time PCR和Western blot检测Med19基因的转录水平及蛋白表达;应用流式细胞术检测细胞周期及凋亡峰;应用MTT、基底膜侵袭实验、细胞克隆形成实验检测细胞增殖、侵袭能力及细胞凋亡。④将siRNA-Med19慢病毒表达载体转染人肺癌A549细胞株,复制裸鼠移植瘤模型,测量肿瘤组织体积及重量,连续病理组织切片, HE染色观察移植瘤及转移瘤结节,并计算各组转移瘤数目和转移率。 结果:①成功构建siRNA-Med19重组慢病毒载体,并经基因测序证实。②成功构建目的基因过表达载体pCDNA3.1-Med19,并与siRNA-Med19重组慢病毒载体共转染293T细胞,Western blot外源验证靶点的有效性。③Real-time PCR及Western blot结果显示,转染siRNA-Med19慢病毒表达载体组中Med19的基因转录及蛋白表达水平明显降低。流式细胞术、MTT、基底膜侵袭实验、细胞克隆形成实验结果显示:siRNA-Med19慢病毒表达载体转染组抑制细胞增殖、侵袭,检测到细胞凋亡。④成功建立裸鼠移植人肺癌模型,siRNA-Med19慢病毒表达载体转染组肿瘤体积及重量均低于对照组。连续病理组织切片观察转染siRNA-Med19慢病毒表达载体组肝脏、肺脏转移率低、转移瘤数目少。 结论:应用RNAi技术沉默Med19基因可以降低人肺癌A549细胞的转录、表达,导致细胞凋亡,抑制肿瘤的生长、侵袭及转移。
【关键词】：肺癌 Med19 RNAi 慢病毒表达载体
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R734.2
【目录】：
  • 提要4-8
  • 英文缩写词表8-10
  • 前言10-12
  • 第一章 文献综述12-52
  • 第一节 Med19 与肿瘤研究进展13-36
  • 1 Med 的发现及其结构13-16
  • 1.1 Med 复合物的发现13-14
  • 1.2 酵母Med 的结构14-15
  • 1.3 哺乳动物的Med15-16
  • 2 Med 的功能16-21
  • 2.1 Med 和RNA 聚合酶Ⅱ之间的相互作用16-17
  • 2.2 Med 与转录激活17-18
  • 2.3 Med 与转录阻抑18-19
  • 2.4 Med 对转录进行调节的机制19-20
  • 2.5 Med 复合物在真核生物发育过程中的作用20-21
  • 3 Med19 的功能21-24
  • 4 Med19 与肿瘤24-25
  • 5 Med19 与信号传导基因异常25-28
  • 6 Med19 与代谢类相关基因异常28-29
  • 7 Med19 与蛋白翻译合成类及其他表达差异基因异常29-30
  • 8 细胞转录的分子机制30-34
  • 8.1 原核细胞转录机制的研究30-31
  • 8.2 真核细胞转录机制的研究31-33
  • 8.3 RNA 聚合酶Ⅱ的转录过程33-34
  • 9 Med19 小结与展望34-36
  • 第二节 RNAi 的研究进展36-52
  • 1 RNAi 的研究历史36-37
  • 2 RNA 干扰的作用机制37-39
  • 2.1 转录后抑制38-39
  • 2.2 转录抑制39
  • 2.3 翻译抑制39
  • 3 RNAi 的作用特点39-41
  • 3.1 高度的特异性39
  • 3.2 高效性39-40
  • 3.3 PTGS 机制40
  • 3.4 高稳定性40
  • 3.5 双干扰系统40
  • 3.6 RNAi 的可扩散性40
  • 3.7 抑制范围广40-41
  • 3.8 RNAi 对细胞调控机制的影响41
  • 4 RNAi 技术要点41-46
  • 4.1 siRNA 的设计41-42
  • 4.2 siRNA 的合成42-43
  • 4.3 siRNA 导入细胞的方法43-46
  • 5 RNAi 技术的应用46-52
  • 5.1 基因功能研究46-47
  • 5.2 制备RNAi 转基因动物47
  • 5.3 临床应用47-52
  • 第二章 siRNA-Med19 慢病毒表达载体的构建与鉴定52-82
  • 第一节 材料和方法53-70
  • 1 材料53-56
  • 1.1 主要试剂53-54
  • 1.2 主要仪器54-55
  • 1.3 质粒与菌株55
  • 1.4 实验细胞55
  • 1.5 抗体55
  • 1.6 培养基55-56
  • 2 实验方法56-70
  • 2.1 siRNA-Med19 慢病毒载体的构建56-61
  • 2.2 目的基因过表达载体构建pCDNA3.1(-)-Med1961-64
  • 2.3 Western Blot 外源筛选有效靶点(protocol)64-67
  • 2.4 有效靶点慢病毒大量包装及滴度测定67-70
  • 第二节 实验结果70-77
  • 1 构建的siRNA-Med19 慢病毒载体的鉴定70-72
  • 1.1 酶切pGCSIL-GFP 载体的琼脂糖凝胶电泳鉴定70
  • 1.2 构建的siRNA-Med19 慢病毒载体琼脂糖凝胶电泳鉴定70-71
  • 1.3 构建的siRNA-Med19 慢病毒载体测序鉴定71-72
  • 2 目的基因过表达载体pCDNA3.1(-)- Med19 的鉴定72-75
  • 3 Western blot 外源筛选靶点75-76
  • 3.1 慢病毒载体共转染293T 细胞情况75
  • 3.2 最佳靶点筛选情况75-76
  • 4 siRNA-Med19 慢病毒载体的包装及滴度测定76-77
  • 第三节 讨论77-82
  • 第三章 RNAi 沉默Med19 基因对人肺癌A549 细胞影响的体外实验研究82-105
  • 第一节 材料和方法83-93
  • 1 材料83
  • 1.1 主要试剂83
  • 1.2 主要仪器83
  • 2 实验方法83-93
  • 2.1 Real-time PCR 验证靶点的有效性(protocol)83-86
  • 2.2 Western blot 验证靶点的有效性(protocol)86-89
  • 2.3 流式细胞仪检测细胞周期和凋亡89-90
  • 2.4 细胞生长抑制实验(MTT 比色实验法)90-91
  • 2.5 细胞侵袭实验91-92
  • 2.6 细胞克隆形成实验92
  • 2.7 统计学处理92-93
  • 第二节 结果93-102
  • 1 细胞生长状况的观察93
  • 2 Real-time PCR 检测转录影响93-96
  • 2.1 慢病毒载体对人肺癌A549 细胞的感染情况93-94
  • 2.2 Real-time PCR 检测siRNA-Med19 对人肺癌A549 细胞Med19 基因转录的影响94-96
  • 3 Western blot 检测siRNA-Med19 对人肺癌A549 细胞Med19 基因表达的影响96-97
  • 4 siRNA-Med19 对人肺癌A549 细胞生长周期的影响97-98
  • 5 MTT 法检测细胞的增殖抑制98-99
  • 6 siRNA-Med19 对人肺癌A549 细胞侵袭、运动能力的影响99-101
  • 7 细胞克隆形成试验101-102
  • 第三节 讨论102-105
  • 第四章 RNAi 沉默Med19 基因对人肺癌移植瘤生长、转移影响的实验研究105-118
  • 第一节 材料与方法106-109
  • 1 主要材料与来源106
  • 2 实验动物106
  • 3 实验方法106-109
  • 3.1 人肺癌A549 细胞的培养、慢病毒转染及裸鼠肺癌移植瘤模型的建立106-107
  • 3.2 观察项目107-109
  • 第二节 实验结果109-114
  • 1 观察裸鼠移植瘤出瘤时间、大小、称重109-110
  • 2 移植瘤组织HE 染色及荧光示踪110-111
  • 3 移植瘤肺脏转移情况观察111-112
  • 4 移植瘤肝脏转移情况观察112-114
  • 第三节 讨论114-118
  • 第五章 结论118-119
  • 参考文献119-134
  • 攻读博士期间发表的论文134-135
  • 致谢135-136
  • 中文摘要136-140
  • Abstract140-145

【引证文献】
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