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水稻抗瘟基因鉴定及稻瘟菌无毒基因监测

靳春鹏  
【摘要】: 稻瘟病是我国水稻主产区的第一大病害,曾多次在我国发生全国性大流行。尤其在东北三省水稻稻瘟病逐年加重。而水稻抗瘟基因型的不明确和稻瘟菌小种变异的规律不清楚是制约稻瘟病病害防治的瓶颈。因此,为防治和控制稻瘟病的发生,开展水稻抗瘟基因鉴定与稻瘟菌生理小种的监测研究,具有实际意义的。目前我国绝大多数水稻栽培品种的抗瘟基因型没有明确。有关稻瘟菌致病性和生理小种变异的工作开展也较晚。目前我们还不清楚稻瘟菌无毒基因与小种变异的规律,更加缺乏小种大规模检测的快速技术。因此,开展水稻抗瘟基因型鉴定与稻瘟菌生理小种的监测研究尤为必要。 本研究就是在这种背景下首先利用全国“948”项目课题组所确定的一套具有不同致病性的22个鉴别菌系,对我省100个水稻主栽品种采用叶片离体接种法鉴定各水稻品种的抗瘟性,鉴定结果表明98%的水稻品种均能够被稻瘟菌侵染,只是有的品种被很多稻瘟菌菌株侵染,而有的是被一个或者几个稻瘟菌菌株侵染。抗瘟性较若的品种有组培11,海132,通育飘香;水稻抗瘟性较强的是吉粳801,丰源18等品种。 利用NCBI网站上GenBank数据库中水稻抗病基因序列,设计6对引物,分别是Pi-b, Pi-ta, Pi-9, Pid-2, Pi-36和Pi-kh,对水稻抗瘟品种进行PCR扩增,发现Pi-9基因分布频率21.4%,Pi-36基因分布频率86.7%,Pi-b基因分布频率25.5%,Pid-2基因分布频率92.9%,Pi-kh基因分布频率98%,Pi-ta基因分布频率94.9%。发现吉林省的水稻主栽品种抗瘟基因Pi-9和Pi-b都明显缺失,而Pi-9是已知的最光谱的抗瘟基因。这从一个侧面也反映出吉林省水稻近年来感病的原因。 而利用克隆的5个无毒基因设计特异引物,PWL2,AVR-CO39,ACE1,AVR-Pib AVR-Pita对吉林省稻瘟菌群体的稻瘟菌菌群进行大量的PCR检测,发现吉林省稻瘟菌,AVR-Pib基因全部都有,AVR-CO39有68.30%,PWL-2有95.40%,ACE1有98.40%。准确、快速分析的分析了稻瘟菌对应无毒基因的有无,利用无毒基因AVR-Pita特异引物对所有菌株基因组DNA进行特异性扩增,出现2kb长度扩增片段的菌株3个,占供试菌株总数的2.4%;1.5kb长度扩增片段的菌株占多数,为41.3%,有52个菌株;1.3kb长度扩增片段的菌株26个,占菌株总数20.6%;45个菌株没有出现特异性扩增带,占菌株总数35.7%。在对所有不同类型扩增产物酶切分析基础上,随机选取相同扩增产物菌株,进行AVR-Pita基因的克隆和核苷酸序列分析从而明确无毒基因毒性变异的主要机制。 AVR-Pita与水稻抗瘟基因Pita符合“gene for gene”关系。通过PCR方法鉴定吉林省水稻对应的抗瘟基因Pita的分布,发现这一基因分布频率较高约为94.9%;但是对采集得到的稻瘟菌菌株进行无毒基因AVR-Pita的PCR鉴定却发现只有三个菌株是正常的扩增片段,而剩余的123个菌株对应的无毒基因均发生了变异或者缺失。而这种变异恰好打破了无毒基因与抗病基因的一一对应的关系,导致稻瘟菌对含有Pita基因的水稻也能够感病。这与近些年来吉林省水稻经常大规模爆发流行稻瘟菌有直接的关系。因此只有通过分子鉴定的方法了解到水稻抗瘟基因和稻瘟菌对应的无毒基因的分布情况,才能够在后续的防治中占据主动。比如AVR-Pita基因的缺失,虽然能够导致稻瘟菌变异引起水稻感病,但是如果通过构建AVR-Pita保守区域诱导性启动子,转入到水稻中,无论无毒基因如何变异,均可以引起水稻Pita基因的作用,这样就可以从根本上防治稻瘟菌AVR-Pita的变异引起的危害。 通过研究无毒基因在病原菌群体中的分布及动态变化,以及对水稻品种抗瘟基因的鉴定在实践上可用于指导抗病品种的合理布局和轮换,以更有效地控制病害发生,也为田间监测稻瘟菌群体的小种动态奠定理论和实践基础。


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