基因工程方法构建高效抗氧化酶

【摘要】： 谷胱甘肽过氧化酶(Glutathione peroxidase,GPx)是机体内重要的抗氧化蛋白酶,它能清除过量的氢过氧化物以保持机体内活性氧(ROS)代谢平衡,从而保护机体免遭氧化损伤。因此,GPx作为抗氧化剂具有巨大的药用价值。但天然GPx异源表达困难、酶水解以及半衰期短等缺点限制了它的生物医学应用,因而设计合成高效GPx抗氧化酶模拟物受到学术界广泛关注。GPx的催化基团是被称为第21种氨基酸的硒代半胱氨酸(SeCys),其三联体密码子为终止密码子UGA,故很难利用传统的基因工程方法表达。因此本论文采用大肠杆菌半胱氨酸营养缺陷型表达体系,从GPx的本质出发,在充分考虑底物结合和分子内催化这两个重要因素的基础上,设计并制备针对不同底物的催化位点明确的高效GPx模拟物。 1.构建碲代谷胱甘肽硫转移酶模拟GPx谷胱甘肽硫转移酶(GST)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)同属于硫氧还蛋白超家族,两者对于共同底物谷胱甘肽(GSH)的结合部位结构基本相同,且催化中心的相对位置相似。与GPx的催化中心硒代半胱氨酸(SeCys)相比,碲代半胱氨酸(TeCys)的氧化还原电势更低:TeCys(-850mV versus Ag/AgCl) vs.SeCys (-640 mV versus Ag/AgCl)。因此,含有TeCys残基的蛋白质必将具有更加优异的氧化还原性能,从而更好的发挥生物学功能。为此,我们以Lucilia cuprina GST为骨架,利用其天然存在的GSH结合部位,采用大肠杆菌半胱氨酸营养缺陷型表达体系首次将催化基团TeCys引入活性中心,获得首例利用基因工程法制备的含碲GPx模拟酶,该含碲酶显示出极高的催化活性,其以GSH为底物的GPx活力可与天然酶相媲美。含碲模拟酶的催化机制为顺序机制,很多酶学性质同天然GPx近似。它的成功还为GPx与GST在进化上具有共同祖先这一假说提供了证据,同时又一次证明了新酶活力进化的主导因素是化学选择性而不是结合专一性。这种普适的含碲GPx模拟物制备方法可以被推广到更多蛋白模型中,从而为研究蛋白质中碲化学以及结构与功能之间关系提供强有力的手段,同时作为抗氧化药物具有一定的应用前景。 2.构建硒代谷胱甘肽硫转移酶模拟GPx谷胱甘肽硫转移酶(GST)可催化GSH的亲电芳环取代反应,其中最具代表性的便是催化GSH与1-氯-2,4二硝基苯(CDNB)的反应。GST除了具有GSH特异性结合部位(G-site),还具有与其比邻的可结合另一底物的H-Site。考虑到CDNB同3-羧基-4-硝基苯硫酚(CNBSH)结构上的相似性,以GST中对于CDNB有非特异性识别的H-Site为识别部位构筑硒酶GPx催化中心。采用大肠杆菌半胱氨酸营养缺陷型表达体系成功将催化基团SeCys引入到H-Site适当位置。通过尿素梯度葡聚糖凝胶柱方法对包涵体复性,得到含硒GPx模拟酶。该酶具有以CNBSH为底物的GPx活力,且对多种过氧化物都显示出催化效率,其中对枯烯过氧化氢(CUOOH)表现出最高活力。稳态动力学表明其催化机制可能为顺序机制。实验再次证实,底物结合及其与酶的催化官能团在空间上的正确定位对获得高效模拟酶至关重要。