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《吉林大学》 2009年
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骨髓间充质干细胞免疫原性及诱导免疫耐受作用的临床应用

米克科  
【摘要】: 目的: 通过对骨髓间充质干细胞(MSCs)免疫耐受作用的初步研究,建立MSCs体外分离、纯化及鉴定的方法,为深入研究MSCs及其广泛应用提供基础。同时,对其免疫调节及免疫耐受作用的初步研究,为其在移植领域内的广泛应用,提供理论依据及实验数据。 方法: 1.MSCs体外分离培养、纯化及鉴定 (1)细胞原代培养:处死乳鼠,取出骨髓,制成单细胞悬液,接种于培养瓶,72h后弃除悬浮细胞,加入新鲜培养液,2-3d换半液一次,至细胞铺满单层,一般时间约1w。 (2)传代:弃去培养液,用胰酶消化,倒出消化液,血清终止,倒出培养液,吹打贴壁细胞,制成细胞悬液,显微镜每天观察,一直到贴壁细胞融合铺满瓶底为止,进行反复传代扩增。每次传代严格控制酶的量和消化时间,以达到纯化MSCs的目的。 (3)生长曲线测定:取生长良好的1,3,5代细胞,胰蛋白酶消化后,制成单细胞悬液,接种于96孔板,24h后,加入DMSO后,酶标仪计数,计算均值,连续6d,每天计数,最后以培养时间为横坐标,OD值为纵坐标,绘制出生长曲线。 (4)细胞周期的测定 取生长比较好的三代细胞,胰酶消化后,制成单细胞悬液,采用流式细胞仪直接荧光法检测细胞周期。用激发光源为15mW氩离子的激光,波长为488nm。FACS软件收集细胞,Lysis软件分析处理数据后,记录阳性细胞百分率。 (5)细胞生长状态观察 在细胞培养过程中,在倒置显微镜下每天观察细胞生长、增殖情况及形态特征,并随时拍照记录。 2.MSCs免疫原性研究 MSCs表面表达很多粘附分子,包括参与T淋巴细相互作用的VCAM-1,CAM-1和LFA3,MSC不表达MHCⅡ分子,Fasl。不表达或极低水平表达MHCⅠ。.MSCs不易被宿主T细胞识别,并能逃脱宿主免疫系统的排斥。本实验用免疫组化染色方法测定。 3.MSCs对免疫反应的抑制作用 MSCs通过抑制细胞间相互接触,阻碍了T细胞与抗原提呈细胞的接触,从而抑制了T细胞的增殖.本实验用胸腺细胞自发增殖活性测定。 4.胸腺细胞自发增殖活性测定 取出MSCs制备单细胞悬液,调节细胞浓度加入96孔培养板中,每一样本作6复孔,第二天在已加入MSCs的96孔培养板中再加上述制备好的胸腺细胞悬液,培养箱培养,收集胸腺细胞加入MTT,等到时间后加入DMSO后,上机检测。 结果: 1.MSCs体外培养情况和形态学特征 接种的骨髓细胞,初始主要为造血细胞,形态多样。培养4天后,可见贴壁细胞,传代后,开始出现梭形或纺锤形成纤维样细胞,突起变大。一周后,细胞融合成单层,梭形细胞突起明显粗大,细胞呈漩涡状排列。2-3代后,细胞形态变得较为均一,绝大部分为细长梭形细胞,也有扁平形带突起的细胞,似成纤维样细胞,细胞可散在生长,也有呈克隆样生长。细胞传代6-7代以后,形态无明显变化,但是扁平形的大细胞增多,梭形细胞减少。6-7代以后,细胞生长有老化现象。 2.MSCs生长曲线 细胞分裂起始比较慢,经过潜伏期以后,进入对数生长期,然后几天后进入平台期。 3.MSC细胞周期 流式细胞仪直接荧光法,检测细胞周期,记录阳性细胞百分率,见73.18%的细胞处于G_0/G_1期,结果表明检测的细胞具有MSCs的生长特性。 4.MSC分化为成骨细胞:先诱导再用碱性磷酸酶染色 5.大鼠MSCs表面MHCⅡ、MHCⅠ类分子的鉴定:采用免疫组织化学染色方法,在光学显微镜下观察细胞染色情况。细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞。 6.大鼠MSCs对异基因大鼠T淋巴细胞的增殖抑制作用:见柱状图(图3.9-3.17) 结论: 1.MSCs的分离培养、纯化及鉴定:细胞分裂初期比较缓慢,经过一段时间的潜伏期后,进入对数生长期。然后进入平台期。MSCs可分化为成骨细胞,MSCs没有明显的形态学特征及特异性表面标志。 2.MSCs免疫原性研究:MSC具有低免疫原性:不表达MHCⅡ,极低表达MHCⅠ类分子,能逃脱免疫排斥。实验数据见(图3.5-3.8) 3.MSCs免疫抑制作用:大鼠MSCs对异基因大鼠T淋巴细胞的增殖抑制:随着时间的延长,耐受作用越明显。随着MSCS数目的增多,耐受作用越明显实验表见(图3.9-3.17)
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R392

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