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小反刍兽疫病毒等温扩增快速检测方法的建立

张忠湛  
【摘要】: 小反刍兽疫(Peste des petits ruminants,PPR)是由副粘病毒科麻疹病毒属的小反刍兽疫病毒(Peste pes petits ruminants virus,PPRV)引起的一种感染小反刍兽的烈性、接触性传染病。该病在临床上以发热、口炎、肺炎和腹泻为主要特征,对小反刍动物,尤其是山羊危害最为严重,野生小反刍动物也可感染,易感动物中发病率高达100%,严重爆发时致死率在90%以上,被OIE规定为必须上报的一类动物疫病。 目前,OIE推荐的PPR核酸检测方法为聚合酶链式反应(Polymerase chainreaction,PCR)。而环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是2000年Notomi T发明的一种新型、快速、可靠核酸诊断方法。因具有简便、快捷、高效和灵敏的特点,在细菌、病毒、原虫及传染病的快速诊断等方面均已得到广泛应用,但目前国内外还没有关于小反刍兽疫LAMP检测方法的报道。因此本研究建立的PPRV-LAMP方法不但具有实际应用价值,也具有较高的科研价值。 PPRV核衣壳(N)蛋白是其主要的结构蛋白,具有多种重要的生物学功能,在致病和免疫机制中发挥着重要作用,是建立小反刍兽疫核酸检测方法的理想位点。本研究利用生物信息学手段,对西藏株China/Tibet/0701 PPRV N基因序列(序列号为EU360596)和GenBank中其他三个系PPRV N基因序列进行对比分析,选取N基因保守性最高的Ⅳ区,依据GC含量,末端稳定性,二级结构等参数,设计筛选出一套最优的LAMP引物用于小反刍兽疫病毒的LAMP扩增。并对LAMP反应体系中的几个重要参数进行了优化,包括温度、dNTP浓度、Mg~(2+)浓度、甜菜碱浓度、Bst DNA Polymerase浓度及引物浓度等。实验结果表明,LAMP体系中Mg~(2+)、dNTP、Bst DNA Polymerase之间具有协同作用,当dNTP浓度为0.4 mM,Mg~(2+)浓度为6 mM,Betaine浓度为1.6 M,Bst DNA Polymerase为8U时扩增效果最佳,在62℃40min内即可完成扩增反应,并可检测到1.6个TCID_(50)小反刍兽疫病毒。 本研究初步建立了一种快速灵敏、高效可靠的小反刍兽疫LAMP检测方法,为后续开发具有实用价值的PPRV-LAMP快速检测试剂盒打下了坚实的基础。


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