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《吉林大学》 2009年
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川金丝猴源柯萨奇B3病毒的分子特征及其致病性初步研究

贺文琦  
【摘要】: 近年来,随着自然生态环境和人工圈养繁殖条件的不断改善,已被列入濒危动物的金丝猴种群数量有所增多,同时又不断有其感染疾病死亡的案例发生。除外伤和天敌等因素外,多种病原菌感染是导致金丝猴死亡的一个重要原因,但未见有病毒感染致死的相关资料。本研究对临床送检的死亡川金丝猴进行了系统的病理学和分子生物学检测,根据临床症状和实验室诊断结果综合分析,揭示该金丝猴的死亡可能与柯萨奇B组病毒感染有关,而且病理特征以病毒性心肌炎为主,并伴发有多个脏器的损伤。进而应用Vero细胞从该猴的心肌组织中成功分离获得一株病毒,对所分离的病毒进行系统的形态学、理化学、动物回归试验和RT-PCR等方法鉴定,确定其为柯萨奇B3病毒(CVB3),将其初步命名为川金丝猴源柯萨奇B3病毒(SSM-CVB3)。经SSM-CVB3免疫家兔制备的抗体用于免疫荧光化学检测结果显示,在金丝猴的心肌、肾等组织的细胞胞浆内呈病毒感染的强阳性反应。从而确诊该猴死于SSM-CVB3感染,这是国内外首次有病毒感染死亡金丝猴的报道。应用5’RACE和3’RACE试剂盒,以及设计合成的5对引物完成了该毒株的全基因组测序,获得其全长基因组共7397bp的序列,并提交GenBank(登录号为GU109481)。对SSM-CVB3的全长基因组序列进行系统的分子特征分析,发现其与GenBank中公布的另外12株CVB3相比在VP2区域有3个核苷酸缺失,导致相应位置的1个氨基酸缺失,同时该区域对应的编码氨基酸也由其他CVB3毒株的LGRTG变为SSM-CVB3毒株独有的WSDW,这一特征性变化可以作为SSM-CVB3毒株的遗传特征。另外,分别位于VP2和2A区域的氨基酸序列AAKEFAGEPI和RNKHFPVS可作为CVB3中国分离株的两个遗传标志。序列比对结果显示,SSM-CVB3的5’-NTR与CVB3F及CVB3B同源性最高,其编码区和3’-NTR均与广州分离株CVB3G的同源性最高,由此推测SSM-CVB3可能为CVB3G和CVB3F或CVB3B重组后的一个新的变种。为了进一步明确该毒株的致病特性,将SSM-CVB3通过腹腔注射途径接种猕猴,从临床病理学和病理形态学等方面进行了系统的分析。从感染后第2天开始,猕猴出现体温升高、一过性的精神沉郁和粥样粪便,其他症状不明显。不同时间点的尿常规检测发现可检出血尿和蛋白尿,其他指标变化不明显。血常规检测结果显示,其白细胞总数和红细胞总数的检测值偏低,在临床检测时有一定的参考价值。血清中的各项酶学指标检测结果证实,在感染的初期CK和CK-MB值均显著升高;第1周内ALT值显著升高,之后下降至正常水平;AMY在感染初期升高,后期下降至正常水平;CRE和BUN值无明显改变。分别于接种病毒后15天和30天剖杀猕猴进行病理学组织学观察,其病变以病毒性心肌炎、间质性肾炎、神经系统的非化脓性炎症及肝脏汇管区有细胞增生性反应为主要特征,其他组织器官也有不同程度的病理变化。说明SSM-CVB3感染猕猴可造成多系统的损伤。本研究不仅为临床上金丝猴疾病的诊断和防治提供参考,为我国流行CVB3的遗传学背景、种系进化关系及流行病学调查和预防研究提供基础,而且为后期建立该病毒感染猕猴的实验动物模型提供依据,具有重要的比较医学意义。
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:S852.65

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