新发感染性疾病的未知病毒性病原体检测及鉴定技术的建立

【摘要】： 本研究利用病毒仅具有“核酸—蛋白质复合体”大分子以及几乎所有医学病毒都具有耐受DNase处理的衣壳蛋白的特征,采用非序列依赖的单引物扩增方法,对DNA病毒经Klenow Fragment补平、RNA病毒反转录成cDNA后再合成双链cDNA,经四碱基限制性内切酶酶切,加接头分子,以此为模板、以接头分子为引物进行单引物PCR扩增；构建PCR产物克隆、测序,在GenBank上BLAST序列比对分析及核酸进化树分析,判断所检测病毒的种属。在此基础上将标本的预处理改在生物安全柜内进行,减少无关核酸的影响。同时,选定乙型肝炎病毒(DNA病毒)和艾滋病毒(RNA病毒)为研究对象,分别收集乙型肝炎和艾滋病病人各3例血清标本,验证上述检测新发未知病毒性感染疾病病原体技术的特异性和灵敏性。结果显示,DNaseⅠ处理血清中内源DNA未观察病毒DNA降解；非序列依赖的单引物扩增血清中病毒DNA核酸可得到多个DNA片段；将所有PCR产物克隆、测序,序列经GenBank BLAST软件比对分析显示,105GE/ml以上拷贝数的病毒被检出,与HBV DNA同源性达98%-100%。与HIV基因序列同源性达91%～97%；以引起手足口病的肠道病毒EV71验证所建立的病毒性病原体的检测技术,非序列依赖的单引物可以扩增粪便标本中病毒核酸得到多个DNA片段：将所有PCR产物克隆、测序,BLAST分析,所得序列中,有的序列与GenBank中登录的EV71基因序列同源性达98%-99%；有的序列与GenBank中登录的单核细胞增生李斯特(Listeria monocytogenes)菌CDC54007同源性达81%。上述研究结果证实,应用所建立的改良的非序列依赖的单引物扩增方法可以检测血清中105GE/ml以上拷贝数的DNA及RNA病毒性病原；上述检测技术不仅适用于血清标本,也适用于粪便标本的检测；检测技术不依赖于被检病毒的核酸序列等信息；可以检测已知病毒,也可以鉴定未知病毒；检测过程不依赖于病毒的分离培养,因此缩短了检测时间,可以快速检测和鉴定病毒性病原体。