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猪传染性胃肠炎病毒纤突蛋白基因体外克隆表达及鉴定

王龙涛  
【摘要】: 猪传染性胃肠炎(Porcine transmissible gastroenteritis,TGE),是由猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起的一种急性、高度接触性肠道传染病。临床特征主要表现为呕吐、脱水和腹泻。不同品种和不同年龄的猪对该病均易感,2周龄以内的仔猪具有高度感染性,致死率可达到100%。目前该病广泛存在于世界各养猪国家,我国作为世界养猪大国也不断有该病发生和流行的报道,该病常常由于混合感染和细菌继发感染,难以确诊,缺乏有效疫苗,给养猪业带来严重危害。 本研究首先对长春市郊养猪户饲养猪群中一起疑似猪传染性胃肠炎病例进行分析,利用PK-15细胞从临床上表现为腹泻症状的病死仔猪肠系膜淋巴结材料中分离获得1株病毒,对该病毒进行病毒形态学、PCR检测与动物回归试验等系统鉴定后,证实该分离株为猪传染性胃肠炎病毒(TGEV),被命名为TGEV JL。对TGEV JL分离株的分离鉴定为进行针对猪传染性胃肠炎病毒的体外克隆表达及转植物疫苗研制提供基本条件。 已有报道,TGEV具有4种结构蛋白,分别为:纤突糖蛋白(S蛋白)、膜内在蛋白(M蛋白)、小膜蛋白(sM蛋白)和核衣壳蛋白(N蛋白)。而其中编码S蛋白的S基因全长约为4300bp,决定宿主的亲嗜性、血凝性和致病性,同时也是诱导机体产生中和抗体的最主要结构蛋白。本研究在获得TGEV JL株的基础上,应用RT-PCR技术扩增获得该病毒株的主要免疫原性基因TGEV S基因全序列,将其连接到pMD18-T载体,进行测序及序列分析,将该基因序列和推导的氨基酸序列与8个不同来源的TGEV毒株进行同源性比较分析,表明该分离株的TGEV S基因高度保守,可作为转植物疫苗研制的目的基因。然后将该基因插入植物表达载体pBI121的CaMV35S启动子下游,成功构建了高效植物表达载体pBI121-S。 玉米是我国主要的粮食及饲料作物之一。饲料消费是玉米最重要的消费渠道,约占消费总量的70%左右。玉米作为饲料消费在我国有两种情况。一是加工生产成配合饲料。二是传统的把玉米直接用于饲料的消费。本研究在获得pBI121-S的基础上,以玉米自交系“丹598”、“H99”和“丹988”的胚性愈伤组织为材料,通过愈伤组织对卡那霉素的敏感性试验,确定了卡那霉素40-56mg/L为愈伤组织适宜选择压。利用基因枪法将猪传染性胃肠炎病毒TGEV JL株S基因的植物表达载体pBI121-S导入玉米自交系中,并对基因枪法转化的条件进行了研究,对转化的愈伤组织进行分化诱导出苗后进行PCR和RT-PCR检测。PCR结果表明,外源目的基因已转入到玉米基因组中;通过RT-PCR试验证明,目的基因能在转基因玉米植株中获得转录。 同时将pBI121-S转入根癌农杆菌EHA101中,成功获得含有重组植物表达载体pBI121-S的农杆菌工程菌。利用农杆菌介导法将TGEV S基因导入玉米自交系中,并对农杆菌转化系统的条件进行了研究。结果表明,根癌农杆菌EHA101的菌液OD600nm值为0.5-0.6时,侵染20min为农杆菌转化的最适条件。对转化的愈伤组织进行分化诱导出苗后进行PCR、Southern blot和Northern杂交检测,证明外源目的基因S已转入到玉米基因组中。以上研究结果为进一步研究猪传染性胃肠炎病毒的转基因植物疫苗及其在兽医临床的应用提供了依据。


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