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狂犬病病毒感染比较蛋白质组学研究

王晓虎  
【摘要】: 狂犬病(Rabies)是一种重要的人兽共患传染病,由狂犬病病毒(Rabies virus,RV)感染温血动物和人后引起,以急性致死性脑脊髓炎,进行性麻痹和最终死亡为主要临床特征。RV属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病病毒属(Lyssavirus)血清/基因1型,单股负链RNA病毒。RV可感染多种温血动物引起死亡,表现为高度嗜神经性。脑组织感染RV后遭到破坏,使得狂犬病感染的病死率几乎100%。尽管狂犬病可以通过疫苗免疫进行预防,全世界每年仍有5.5万人死于该病,在亚洲,每年约3.5万例,其中我国每年有2000~3000例。 随着微生物学尤其是病毒学实验技术的不断发展,人类对狂犬病本质的认识逐渐深入。探索抗狂犬病病毒感染的研究一直是狂犬病研究领域中的重要课题之一。狂犬病病毒的感染(即暴露)通常发生在外周,但感染的最终靶组织是中枢神经系统。我们在试验中发现,使用灭活的SRV9首先脑内接种,72小时之前对脑内进行强毒的直接感染不具有任何保护力,在第6天后方能完全保护;与此同时,如果脑内首先接种狂犬病病毒SRV9活毒株48小时后,在小鼠脑内进行强毒的直接感染试验,则可100%保护。按照免疫学理论和一般的规律,抗体不可能产生如此迅速,SRV9脑内接种第4天以后产生的中和抗体方能完全达到保护水平。因此说明,脑组织中存在着另外的早期免疫应答系统,阻止了狂犬病病毒强毒的感染。病毒的感染与致病是病毒因素和宿主细胞因素相互作用的结果,因此,深入研究RV和宿主细胞的相互作用以及宿主细胞功能的改变对揭示RV的致病机制及发病机理显得十分必要。 基于二维凝胶电泳和质谱分析的蛋白质组学研究近年来不断发展和完善,是发现疾病相关蛋白,寻找早期诊断标记和揭示致病机制等的有力工具之一。利用蛋白质组学技术研究病毒,并与传统病毒学方法相结合,对病毒及相关宿主,嗜性组织蛋白的表达、翻译后修饰、定位、相互作用和功能进行系统的研究,有助于深入了解病毒复制、与宿主相互作用以及引发疾病的机制。比较感染和未感染组织/细胞蛋白质组的变化,可以获得大量关于组织/细胞对病毒感染产生的反应应答模式以及细胞生理功能改变的信息。 本研究使用基于2-DE,质谱鉴定的蛋白质组学技术比较分析了感染RV前后,易感细胞和动物的差异表达蛋白信息,获得了多个因RV感染诱导的宿主细胞蛋白质组上的差异表达信息。包括CVS-11,SRV9,BD06感染和未感染N2a细胞的蛋白质组差异表达模式,SRV9和BD06感染昆明系小白鼠前后脑组织蛋白质组差异表达模式, SRV9感染致死日龄前后的乳鼠脑组织蛋白质组差异表达模式。随后,用MALDI-TOF MS/MS串联质谱和离子高淌度质谱鉴定差异蛋白点,并通过生物信息学手段对差异表达蛋白质进行功能注释。 首先,对三株具有不同细胞适应性和毒力的狂犬病病毒CVS-11、SRV9、BD06感染和未感染的N2a细胞进行了差异蛋白质组学分析。结果显示,在病毒感染后48h共有41个蛋白点的表达水平发生了至少2.0倍的上调或下调变化,在这些差异表达蛋白中,质谱成功鉴定出32种蛋白质。推测蛋白差异表达的原因:a-enolase、Prx-4、Prx-6等蛋白质在各感染组均称上调表达,Trx、Galectin-1等均呈下调表达,这些蛋白的差异表达在三株RV感染细胞时一致,可能与RV感染诱导的应答模式密切相关;CIAPIN1、a-enolase、Prx-4、Trx、HSP-1等蛋白的表达量在SRV9和CVS-11感染组较一致而与BD06感染组存在显著差异,这些蛋白差异表达可能是因为毒株的细胞适应性不同,在N2a细胞内增殖的速度不同,引起了不同的应答结果; Zfp12 protein、Spf-arg/ser 1的表达量在BD06和CVS-11感染组一致,但显著低于SRV9感染组,可能是由于RV毒株毒力的差异导致感染细胞的应答结果不同。 其次,对SRV9,BD06感染和未感染的小鼠脑组织样品进行了差异蛋白质组学分析。结果显示,在病毒感染后48h共有9个蛋白点的表达水平发生了至少2.0倍的上调或下调表达变化。在这些差异表达蛋白点中,离子淌度质谱成功鉴定出8种蛋白质,其中Glo1、SLP-2、lysoPLA2、Prx-3等蛋白的差异表达可能与RV感染的分子机制以及SRV9和BD06对小鼠表现的不同致病力相关。 最后,使用SRV9分别感染10日龄和20日龄的乳鼠,并设立相应对照,对感染和未感染的乳鼠脑组织样品进行了差异蛋白质组学分析。结果显示,10个蛋白点的表达水平发生了至少2.0倍的上调或下调表达变化。离子淌度质谱成功鉴定为8种蛋白质,其中hnRNP L、DPYSL3、NECAPs以及转醛醇酶等蛋白可能与不同日龄乳鼠对SRV9的易感性密切相关。 综上所述,不同毒株RV感染细胞和宿主产生的蛋白组差异,既共同体现了细胞和宿主对RV感染的应答模式,也表现出了不同毒株感染相互间的差异。对获得的差异蛋白数据和差异蛋白组功能的进一步研究,将有助于揭示RV对细胞和宿主感染以及强弱毒株在致病性上差异的分子机制。


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