草苁蓉环烯醚萜苷的肝损伤保护作用及抑瘤作用的研究

【摘要】：第一部分 草苁蓉环烯醚萜苷对四氯化碳所致大鼠急性肝损伤的保护作用 目的：观察草苁蓉环烯醚萜苷(IGBR)对四氯化碳(CCl4)所致肝损伤的保护作用。 方法：1. IGBR的制备：将10 kg草苁蓉全草切碎后用90%乙醇提取,将提取液减压浓缩,获草苁蓉醇提取物1.86 kg。将醇提取物加水溶解,在等体积二氯甲烷中进行萃取分离。取其水层提取物,上MCI-gel CHP20P凝胶柱(Mitsubishi Chemical Co.),用10%-100%甲醇梯度洗脱,收集50%甲醇洗脱成分,经高效液相层析分离得到IGBR。2.建立CCI4肝损伤模型：大鼠腹腔内注射CCl4(1ml/kg),制备大鼠急性肝损伤模型。3.动物分组及处理：将雄性Wistar大鼠,重(160-180 g)50只,随机分成5组,每组10只,即正常对照组(groupⅠ)、模型组(groupⅡ)、IGBR低剂量组(groupⅢ)、IGBR高剂量组(groupⅣ),、益肝灵组(groupⅤ)。首先将IGBR和益肝灵溶于0.5%羧甲基纤维素中,然后IGBR低、高剂量组和益肝灵组分别灌胃IGBR (100、200mg/kg)和益肝灵(50mg/kg),正常对照组和模型组以等体积的0.5%羧甲基纤维素溶液灌胃,每天一次,连续7天。第7天最后一次给药后1小时,将50%CCL4橄榄油按1 ml/kg剂量注射至Ⅱ-Ⅴ组大鼠腹腔内,而Ⅰ组只注射同体积的橄榄油。腹腔注射CC1416h后,断头取血及肝组织,进行肝组织病理学观察。分离血清,测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、白蛋白(ALB)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、丙二醛(MDA)、脂氢过氧化物(LOOH)、谷胱甘肽(GSH),测肝组织超氧化物歧化酶(SOD)、铜锌超氧化物岐化酶(Cu/Zn-SOD)、二氧化锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽还原酶(GR)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、脂氢过氧化物(LOOH)、谷胱甘肽(GSH)和一氧化氮合酶(iNOS)、细胞色素P4502E1(CYP2E1)表达。 结果：HE染色结果表明,IGBR高、低剂量组和益肝灵组,大鼠CCl4所致肝损伤明显减轻。在大鼠血清中,与正常组相比,CC14肝损伤模型组的ALT、AST、TNF-α水平明显升高；与模型组比较,IGBR高、低剂量组和益肝灵组明显降低CCl4所致急性肝损伤大鼠血清ALT、AST(除IGBR低剂量组外)、TNF-α水平,IGBR高剂量组和益肝灵组血清ALB水平明显提高。在大鼠肝组织中,与正常组比较,CCl4肝损伤模型组的SOD、Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、GPx、GR和CAT活性降低；与模型组比较,IGBR高剂量组和益肝灵组肝组织中的SOD、Mn-SOD、GPx(益肝灵组除外)、GR和CAT(包括IGBR低剂量组)活性升高。在血清及肝组织中,与模型组比较,IGBR高剂量组和益肝灵组MDA含量都明显降低,IGBR低剂量组的MDA只有在肝组织中明显降低,且IGBR高剂量组LOOH含量都明显降低,而益肝灵组的LOOH只有在血清中明显降低,IGBR高剂量组和益肝灵组中GSH的活性明显升高；与IGBR低剂量组比较,IGBR高剂量组GSH活性明显升高。与模型组比较,IGBR高剂量组和益肝灵组对CCl4诱导的肝组织iNOS的表达异常增高有显著降低作用,IGBR高剂量组对CCl4诱导的肝组织CYP2E1蛋白表达明显增高,IGBR高剂量组对CCl4诱导的肝组织CYP2E1-特异的单氧合酶的活性有明显增高作用,且同IGBR低剂量组比较,活性明显增高。说明IGBR高剂量组能抑制肝iNOS的表达,提高CYP2E1蛋白含量及恢复其功能。 结论：草苁蓉环烯醚萜苷对CC14所致的大鼠急性肝损伤具有保护作用。机制可能与草苁蓉环烯醚萜苷抑制脂质过氧化、增高抗氧化酶活力、抑制炎症反应、恢复CYP2E1功能和抑制iNOS的表达有关。 第二部分草苁蓉环烯醚萜苷对H22小鼠肝癌移植瘤的抑瘤作用 目的：目前草苁蓉提取物环烯醚萜苷的研究尚不多见,本研究通过建立H22肝癌移植瘤模型,探讨草苁蓉环烯醚萜苷对小鼠H22移植瘤的生长抑制作用。 方法：1. IGBR的制备：将10kg草苁蓉全草切碎后用90%乙醇提取,将提取液减压浓缩,获草苁蓉醇提取物1.86 kg。将醇提取物加水溶解,在等体积二氯甲烷中进行萃取分离。取其水层提取物,上MCI-gel CHP20P凝胶柱(Mitsubishi Chemical Co.),用10%-100%甲醇梯度洗脱,收集50%甲醇洗脱成分,经高效液相层析分离得到IGBR。2.建立H22皮下移植瘤模型：常规方法复苏H22小鼠肝癌细胞,取0.2mL细胞悬液注射到雄性昆明小鼠腹腔内,连续传两代。无菌操作取第2代腹水,用无菌生理盐水稀释,调整细胞密度为1×107个/mL取0.2mL瘤细胞悬液接种到雄性昆明小鼠的右腋窝皮下[4]。3.动物分组及处理：接种后第二天,随机分成模型组、IGBR高剂量组、中剂量组、低剂量组和5-氟尿嘧啶(5-Fu)组,每组各10只。IGBR高、中和低剂量组分别按400、200和100 mg/kg-d剂量ig给药,每日1次,共10次；5-Fu组按25 mg/kg·d剂量隔日ip给药,共5次；模型组则以生理盐水替代药物ig给药。各组动物给药第10 d停药,禁食不禁水16 h后处死。另设正常组10只,每天生理盐水ig给药,共10 d。取瘤、脾脏、胸腺并称重,计算抑癌率及瘤组织病理学观察。眼眶取血,分离血清TNF-α、IL-2、T-AOC和MDA含量。琼脂糖凝胶电泳技术分析药物对DNA的作用,测定微血管密度(MVD),免疫组织化学法检测瘤组织中VEGF、KDR和HIF-1α表达。 结果：1.IGBR对肝癌H22移植瘤小鼠抑癌率的影响：IGBR低、中、高剂量组小鼠肝癌H22移植瘤的生长有明显抑制作用。与模型组比较,IGBR低、中、高剂量组和5-Fu组肝癌H22移植瘤小鼠瘤重显著减轻。与5-Fu组比较,IGBR各剂量组小鼠瘤重均显著增高,IGBR各剂量组抑癌率明显低于5-Fu组。2. IGBR对小鼠试验后体重及免疫器官指数的影响：试验末期IGBR高剂量组小鼠脾指数与模型组比较差异显著,与IGBR低、中剂量组比较差异显著。5-Fu组小鼠体重、胸腺指数和脾指数均低于模型组,也低于IGBR各组。3. IGBR对血清TNF-a和IL-2水平的影响：与正常组比较,模型组小鼠TNF-a显著增高,IL-2显著降低。与模型组比较,IGBR低、高剂量组和5-Fu组TNF-a显著降低,而IGBR各剂量组和5-Fu组IL-2显著增高。4. IGBR对血清抗氧化指标的影响：与正常组比较,模型组小鼠MDA含量显著降低,但T-AOC无显著性差异。与模型组比较,IGBR各剂量组小鼠血清MDA含量显著降低,血清T-AOC显著提高；同时,IGBR各剂量组小鼠血清T-AOC也明显高于5-Fu组；IGBR高剂量组T-AOC与IGBR低、中剂量组比较差异显著。5. IGBR可激活核酸内切酶,在核小体间规则地切割DNA,而且各浓度的药物诱导核酸内切酶切割DNA小片断的大小相等。6.模型组小鼠肿瘤组织毛细血管大量增生,IGBR组和5-Fu组肿瘤边缘区毛细血管明显减少。与模型组比较,IGBR组平均血管密度均有明显减少,并呈现量-效关系。7.免疫印迹结果显示：与模型组组比较,在IGBR组、5-Fu组中血管生成及调控因子VEGF、KDR和HIF-1α的蛋白表达水平分别有明显差异,这些因子的表达水平随着IGBR浓度的增加而分别减少。 结论：IGBR对H22移植瘤具有明显的抑制作用,其作用可能与其抑制新生血管生成、增高机体免疫机能和抗氧化能力有关。

【关键词】：草苁蓉环烯醚萜苷 CCl_4 肝损伤 草苁蓉环烯醚萜苷(IGBR) 肝癌H_(22) 微血管密度(MVD) 血管内皮生长因子(VEGF)
【学位授予单位】：延边大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R285.5
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