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PI3K抑制剂联合组蛋白去乙酰化酶抑制剂对乳腺癌协同杀伤作用的分子机制研究

陈丽艳  
【摘要】:研究背景:乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤之一。近年来我国乳腺癌的发病率上升趋势明显,高居女性恶性肿瘤发病率的第一位。尽管手术治疗和术后多种辅助化疗对患者的预后有明显的改善,但是乳腺癌仍具有较高的复发率和死亡率。研究表明,乳腺癌的增殖及耐药是导致患者死亡的主要原因。因此,明确乳腺癌的发生发展机制,寻找有效的治疗靶点是延长乳腺癌患者生存时间的关键。分子靶向治疗是当今乳腺癌药物治疗的最新发展方向,目前已有分子靶向相关药物应用于临床。最近研究表明,与单靶向治疗相比,多靶点药物联合应用显示出更有效的治疗作用。NVP-BEZ235是PI3K/mTOR双靶点抑制剂,可有效抑制多种肿瘤的增殖;曲古霉素(TSA)为组蛋白去乙酰化酶抑制剂,是新型的抗肿瘤药物。有关BEZ235与TSA联合应用在非小细胞肺癌及胰腺癌中的研究已有报道,但在乳腺癌中的作用及机制尚不清楚。前期研究发现,PI3K通路及蛋白乙酰化修饰在乳腺癌的发生发展中起重要的作用,因此,深入研究BEZ235与TSA两种抑制剂联合应用对乳腺癌的抑制作用及其分子机制有重要的临床指导意义。研究目的:本研究通过体外细胞学实验检测BEZ235和TSA联合用药对乳腺癌细胞生物学行为的影响,并探讨其协同抑制肿瘤增殖的作用及可能的分子机制,为乳腺癌靶向治疗提供新的药物选择方案。材料和方法:通过MTT法观察BEZ235、TSA单独或联合用药对不同乳腺癌细胞系T47D, SKBR3, MDA-MB-231, MCF-7, MDA-MB-468, MDA-MB-453增殖情况的影响,分析BEZ235与TSA联合用药的协同作用;通过平板克隆形成实验检测联合用药对乳腺癌细胞增殖的抑制作用;通过划痕实验观察联合用药对细胞迁移能力的影响;通过基因芯片筛查发现单独用药与联合用药组乳腺癌细胞的差异基因表达谱,初步明确联合用药的可能作用机理;采用流式细胞术及Hoechst33342细胞核染色法检测药物处理后的乳腺癌细胞凋亡率的变化;Western blot方法检测BEZ235及TSA处理后PI3K/Akt信号通路及HDAC相关蛋白的改变,并进一步分析联合用药诱导乳腺癌细胞凋亡与自噬相关因子的变化。结果:MTT结果显示,BEZ235与TSA可协同抑制乳腺癌细胞株MCF-7、T47D细胞的增殖;平板克隆实验显示联合用药后,MCF-7、T47D细胞克隆形成能力明显下降;划痕实验结果表明联合用药可明显抑制MCF-7和T47D细胞的迁移能力;联合基因芯片检测结果表明联合用药可明显改变乳腺癌细胞MCF-7生存及死亡信号通路相关mRNA表达情况;Hoechst33342染色结果显示联合用药可诱导乳腺癌细胞MCF-7、T47D的凋亡,同时流式细胞术检测结果表明联合用药主要促进乳腺癌细胞的晚期凋亡;Western blot结果显示BEZ235及TSA联合用药可进一步下调PBK/Akt/mTOR信号通路蛋白,上调PARP蛋白的表达及降低Bcl-2/bax比值,通过促进caspase-3、8、9蛋白的活化诱导凋亡;同时,联合用药可增加自噬标志蛋白LC3B、Beclin1的表达,经过自噬抑制剂3-MA处理30分钟后,联合用药组的LC3B表达下降,而caspase3和PARP的表达明显增强。结论:1)BEZ235与TSA联合用药可协同抑制乳腺癌细胞的增殖、克隆形成及迁移能力:2)BEZ235与TSA联合用药对乳腺癌细胞的协同抑制作用与PI3K/Akt/mTOR通路进一步抑制有关;3)BEZ235与TSA联合用药协同抑制乳腺癌的作用与依赖caspase途径诱导凋亡和促进自噬形成均密切相关。


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