小白菊内酯对人宫颈癌Hela细胞抗肿瘤作用机制的研究

【摘要】：多年来,肿瘤一直是临床上的常见病,而且大多数恶性肿瘤对人类来说仍然是不治之症,是困扰医生的难题。传统的肿瘤治疗依然是手术、放射性治疗以及化学药物治疗。目前临床用的化学药物存在着毒副作用大,对患者损伤严重的缺点,所以很多科研人员把目光投入到了毒副作用小的传统中药上来,通过对新型抗肿瘤药物的开发,来提高抗肿瘤作用以及患者的生存质量。小白菊内酯(parthenolid,PTN)属于倍半萜内酯,是墨西哥、印度药用植物的活性成分,也是欧洲小白菊这一常用草药的活性成分,主要用于治疗偏头痛、炎症和各种肿瘤。随着中药抗肿瘤研究的深入,对小白菊进行研究的学者越来越多,对小白菊的各种功效的探讨已经逐步完善。本实验通过小白菊内酯对多种瘤株的抗肿瘤作用及对宫颈癌hela细胞的抑制机制探讨,旨在阐明小白菊内酯的抗肿瘤作用机理。本研究首先采用MTT法检测了小白菊内酯体外对多种肿瘤细胞的抗增殖作用,包括了人肺癌A-549细胞株,人肝癌HepG2细胞株,人肝癌Hep3B细胞株,人宫颈癌Hela细胞株和小鼠黑色素瘤B-16细胞株;通过免疫细胞化学方法检测了小白菊内酯对人宫颈癌hela细胞中Ki-67、Bcl-2、NF-KB、Caspase-9、Caspase-8和Caspase-3基因蛋白的表达变化;应用HE染色、倒置显微镜、透射电镜等方法对小白菊内酯作用于人宫颈癌hela细胞株后形态学的改变进行了观察;应用PI染色法通过流式细胞仪检测了小白菊内酯对人宫颈癌hela细胞引起的凋亡作用以及细胞周期的变化;应用PCR方法检测了凋亡通路的相关基因mRNA表达,应用Western Bloting方法检测了细胞周期相关蛋白和凋亡通路相关蛋白表达的变化;通过划痕实验检测了小白菊内酯对人宫颈癌hela细胞的迁移能力的影响;用Western Bloting实验方法检测了twist蛋白的变化;应用ELISA方法检测了caspase-9、caspase-3进行了检测,同时检测了SOD、CAT活力。通过实验,希望能够阐明小白菊内酯对人宫颈癌hela细胞抑制作用的机理,争取为小白菊内酯抗肿瘤作用的开发提供足够的理论依据。主要方法和结果:1、MTT比色法检测对肿瘤细胞的抑制率MTT结果显示小白菊内酯对人肺癌A-549细胞株,人肝癌HepG2细胞株,人肝癌Hep3B细胞株,人宫颈癌Hela细胞株和小鼠黑色素瘤B-16细胞株均有明显抑制增殖作用。2、形态学观察应用倒置显微镜,我们发现对照组细胞贴壁生长良好,经小白菊内酯处理后细胞变圆,贴壁不牢固,细胞生长明显受到抑制。HE染色、应用光学显微镜我们观察到了与倒置显微镜同样的改变,并可见染色质边集,细胞固缩,凋亡小体等典型的凋亡形态学改变。透射电镜观察发现小白菊内酯处理组凋亡和变性死亡的细胞增多,可见大小不等的凋亡细胞和凋亡小体。3、流式细胞术检测结果我们用酒精处理细胞PI染色,结果显示小白菊内酯能够改变hela细胞周期分布。24h时对照组G0/G1期细胞占42.39%,G2/M期细胞占15.68%,S期细胞占31.05%;而小白菊内酯组G0/G1期细胞明显增多,为61.85%,G2/M期和S期细胞百分比均比对照组减少,分别为11.520%和24.67%。48h时对照组G0/G1期细胞占47.06%,G2/M期细胞占14.81%,S期细胞占32.38%;小白菊内酯组G0/G1期细胞占67.35%,G2/M期细胞占9.28%,S期细胞占26.51%;对照组和实验组相比较均有统计学意义(P0.01),而24h和48h实验组相比较差异不显著。可以看出小白菊内酯能够改变细胞周期的分布,使G,期细胞的百分比明显增高,S和G2期细胞明显降低,使细胞阻滞在G1期,干预了细胞增殖。而凋亡检测结果显示,小白菊内酯处理组细胞凋亡指数明显高于对照组,二者比较有显著差异。4、RT—PCR 结果p53、bax、caspase-9和caspase-3mRNA在Oh组的表达都处于低水平,小白菊内酯作用于Hela细胞后24h和48h,随着作用时间的延长,Hela细胞内的p53、bax、caspase-9和caspase-3mRNA水平明显升高,与未经小白菊内酯处理(0h)相比,有显著性差异(P0.01),除caspase-9外24h组和48h组之间无明显改变,两组之间无统计学意义(P0.05)。Bcl-2mRNA在Oh组表达处于高水平,在小白菊内酯作用于Hela细胞后24h和48h后,水平明显降低,与Oh组表,均有统计学意义(P0.05,P0.01)。5、小白菊内酯对HeLa细胞色素C水平的影响结果显示应用细胞色素c单克隆抗体检测出特异性条带,小白菊内酯作用后8h细胞质内细胞色素c水平明显升高,与Oh相比,有统计学意义。在24h细胞色素c升高最明显,然后有下降的趋势。6、小白菊内酯对HeLa细胞活化caspase-9和caspase-3表达的影响ELISA结果显示小白菊内酯作用于Hela细胞后24h和48h,细胞内的caspase-9和caspase-3的活性明显增强,与未经小白菊内酯处理(0h)相比,有显著性差异(P0.01),但24h组和48h组之间明显改变,两组之间无统计学意义(P0.05)。7、免疫细胞化学染色检测我们通过免疫细胞化学检测方法检测了小白菊内酯对hela细胞中的Bcl-2、Bax、NF-κB、Caspase-9、Caspase-8和 Caspase-3表达变化,发现它的表达水平发生了明显的改变。利用公式计算出了蛋白阳性表达率,其差异具有统计学.意义(P0.05)。结果表明小白菊内酯能够降低了 hela细胞中bcl-2、NF-κB蛋白的表达,同时能够提高Caspase-9、Caspase-8和Caspase-3的表达。8、Western Bloting实验我们通过WestemBloting方法检测了p53、bcl-2、bax等蛋白的表达变化。发现了小白菊内酯明显下调了bcl-2白的表达水平,并上调了抑制因子p53、bax基因蛋白表达水平,实验组和对照组相比较有显著差异(P0.01)。9、细胞迁移能力实验细胞划痕实验发现小白菊内酯处理之后的细胞增殖变慢,边缘的细胞变圆,间隙也变宽;而对照组细胞往划痕区域继续生长,修复划痕区域,实验组和对照组相比较有统计学意义(P0.01)。同时通过Western-blot法发现twist蛋白表达下降。10、小白菊内酯对HeLa细胞内SOD和CAT活力影响小白菊内酯处理Hela细胞不同时间,细胞内SOD和CAT活力单位均表现出不同浓度,活力曲线呈上升趋势,SOD和CAT活力在小白菊内酯处理24h和48h后上升明显,与未经小白菊内酯处理(0h)相比,有显著性差异(P0.01)。研究结论:1.小白菊内酯具有较广泛的抗肿瘤作用。2.小白菊内酯对人宫颈癌hela细胞具有抗增殖作用。3.小白菊内酯能诱导人宫颈癌hela细胞凋亡,其作用可能是通过线粒体途径,并且促进线粒体细胞色素C外流,引起细胞凋亡。4.小白菊内酯对hela细胞的诱导凋亡作用可能与细胞周期发生G1/S期阻滞有关。5.小白菊内酯能够影响hela细胞内活性氧水平,从而引起细胞凋亡6.小白菊内酯能够使人宫颈癌hela细胞的迁移运动能力,其机制可能和下调twist蛋白表达有关。7.小白菊内酯有望开发成一种新的抗肿瘤药物。