猪附红细胞体病PCR诊断方法的建立

【摘要】：猪附红细胞体病(Eperythrozoonosis)是由猪附红细胞体(Eperythrozoon suis)寄生于猪红细胞表面、游离于血浆及骨髓中而引起的以仔猪发热、贫血和黄疸，母猪流产等症状为特征的疾病。该病常和其它猪病混合发生，临床上防治困难，给养猪业造成巨大经济损失。传统的诊断方法主要有血液涂片染色镜检和直接血液压滴镜检；血清学诊断主要有补体结合试验，荧光抗体试验，间接血凝试验等方法，而这些方法均有不同程度的不足点。现代化生产需要建立一种特异、快速、敏感的检测方法。 本试验对GenBank中报道的猪附红细胞体的基因序列进行同源性比较分析，选择猪附红细胞体的保守序列作为扩增区域。利用Oligo6.0和Primer Premier5.0软件设计筛选出合适的一对PCR引物，扩增片段为541bp，并成功的连接到pGEM-T Easy载体上，构建了含有猪附红细胞体特异基因片断的重组质粒，经限制性内切酶Not Ⅰ酶切分析、PCR鉴定以及序列分析，验证所克隆的基因为猪附红细胞体特异性基因，建立了猪附红细胞体病的PCR诊断方法。测得的猪附红细胞体基因序列与广东株猪附红细胞体基因序列(AY492086)同源性为100％，与美国株猪附红细胞体基因序列(U88565)同源性为97％。特异性和敏感性试验结果表明，该诊断序列不能扩增出弓形虫、链球菌、沙门氏杆菌、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌DNA和猪瘟病毒cDNA；当样本中猪附红细胞体DNA含量为56.25fg／μl时，仍可扩增出清晰可辨的条带。利用PCR技术对55头份来自吉林省、黑龙江省、浙江省的血液样本进行检查，检出率为94.5％，所建立的PCR诊断方法具有特异、快速、敏感等优点，为猪附红细胞体病的诊断提供了一种可靠的诊断方法。