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《延边大学》 2006年
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重症肌无力抗乙酰胆碱受体单链抗体A7基因真核表达载体的构建

李强  
【摘要】:重症肌无力(myasthenia gravis,MG)是抗乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor,AchR)抗体介导的器官特异性自身免疫病。AchR是由α_2β_γδ五个同源亚单位组成的跨膜糖蛋白,MG患者血清中多数抗AchR抗体针对的是α亚单位上的主要免疫原区(main immunogenic region,MIR)。当致病性抗体与神经肌肉接头处突触后膜上相邻两个AchR α亚单位上的MIR相结合后,通过抗原调变或激活补体作用使突触后膜损伤,AchR数量减少,结果出现肌肉收缩无力。由抗AchR抗体制备的单链抗体(single chain variable fragment,ScFv)作为单价片段,只能与一个α亚单位上的MIR结合,因此不引起抗原调变作用,且ScFv无Fc段,不能激活补体导致AchR损伤;但是,ScFv与MIR结合后,可以特异性地封闭抗AchR抗体的结合位点,从而对AchR起到保护作用。 本实验应用聚合酶链反应(PCR)方法从重组质粒pHEN2-ScFvA7上扩增出鼠源性ScFvA7基因,应用纯化试剂盒进行纯化。纯化后的PCR产物经EcoR Ⅰ和AvrⅡ双酶切后用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收并纯化,再与经同样酶切并纯化的真核表达载体pPIC9K连接。将连接产物转化E.coli DH5α并扩增,再用AvrⅡ和EcoR Ⅰ酶切检查ScFvA7基因插入的正确性。构建pPIC9K-ScFvA7重组载体经测序发现核苷酸序列正确,并且ScFvA7基因正确克隆至载体开放读码框架内。结果表明已成功的构建了pPIC9K-ScFvA7重组表达载体,为下一步进行真核表达及之后对MG的基因治疗奠定了基础。
【学位授予单位】:延边大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:R392

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