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《延边大学》 2007年
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重症肌无力单链抗体A7在毕赤酵母中的表达及检测

韩晓敏  
【摘要】: 目的:将抗乙酰胆碱受体单链抗体(single chain variable fragment,ScFv)基因转化至毕赤酵母GS115,筛选阳性转化子并诱导蛋白表达,制备单链抗体蛋白。方法:从Ecoli.DH5α中提取目的基因并纯化,将电泳检查后确认正确的pPIC9K重组载体经过限制性核酸内切酶Sal I线性化处理,电穿孔导入甲醇营养型毕赤酵母GS115中,提取酵母基因组DNA进行PCR,检测外源基因的插入情况。挑取拷贝数高的阳性转化子进行甲醇诱导表达,应用鼠抗c-myc单克隆抗体进行斑点杂交试验检查酵母培养上清液中单链抗体A7蛋白的表达情况。并用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹试验(WesternBlotting)确认目的蛋白的分子量。结果:电泳检查发现了大小分别为10000 bp和9300 bp左右的重组载体pPIC9K-ScFvA7基因和真核表达载体pPIC9K基因片段;经PCR后电泳确定目的基因已整合到毕赤酵母染色体基因组中。经检测得知,诱导表达后的酵母培养液上清中有目的蛋白表达,而对照酵母培养液上清未发现目的蛋白的表达。在SDS-PAGE和蛋白印迹试验中发现一条分子量约为44KD的单一带。结论:成功将重组载体pPIC9K-ScFvA7整合到毕赤酵母染色体基因组中,使ScFvA7蛋白在毕赤酵母中成功表达,并对此基因的表达情况进行了初步鉴定,为下一步鉴定目的蛋白活性及特异性奠定了基础,也为今后单链抗体对重症肌无力的治疗和基因治疗准备了材料。
【学位授予单位】:延边大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R392

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