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RAPD及SRAP技术在长白山区部分野生菊科植物系统分类学中的应用研究

李颖  
【摘要】: 菊科(Compositae)是种子植物中含有的属、种数最多、分布最广、亲缘关系及系统演化极复杂的一个科,具有较高的理论研究和经济价值,已广泛受到世界各国学者的重视。该科植物在长白山区有150多个野生种,这些种类分布广泛,生境复杂,适应性较强,是宝贵的遗传资源。本研究利用RAPD和SRAP技术相结合对长白山区16份野生菊科植物材料进行遗传多样性及聚类分析,为揭示其属种间关系、起源和演化提供理论依据;运用该技术对部分野生菊科植物进行亲缘关系分析,探讨RAPD及SRAP技术用于属种间亲缘关系研究的可行性,为深入研究这些植物各属种间亲缘关系提供更为详实的分子证据。 主要研究结果如下:1.以改进的CTAB法提取植物基因组DNA,并进行纯化处理。本实验依据大量参考文献将Mg2+、dNTP、模板、引物浓度和Taq DNA聚合酶用量这5个因素全选为优化因子,并采用正交设计对RAPD的反应体系进行优化,得到最终的RAPD反应条件为:2.5μL 10XPCR buffer,40ng模板DNA、Mg2+ 2.0 mmol/L、dNTP 2.0 mmol/L、引物0.4μmol/L、Taq DNA聚合酶1U,总体积为25μL。扩增反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,40℃退火1 min,72℃延伸2 min,40个循环;循环结束后,72℃延伸10 min。2.采用RAPD技术对16份供试材料进行了遗传多样性分析,从100个UBC引物中筛选出了重复性好的、有丰富多态性的16个引物,共产生239条多态性条带,各个引物产生的多态性条带数不一,变幅在9-20条不等,多态性为100%。根据RAPD二元数据结果,计算出了16份供试材料的遗传相似系数,并根据UPGMA法进行了聚类分析,建立了聚类分析树状图。依据此图:16份供试材料的GS的值在0.5348-0.7720之间,GS值在0.66为阈值时,16份供试材料可分为4大类,分别为:第1类为苦荬菜、牛蒡、烟管蓟、大刺儿菜、小花鬼针草、菊芋、稀莶、小飞蓬、苍耳、笔管草、地丁草、狼把草;第2类为山莴苣;第3类为苦苣菜、马兰花;第4类为艾蒿。GS值在0.70为阈值时,将第1类分为8小类为:①苦荬菜②牛蒡、烟管蓟③大刺儿菜、小花鬼针草、菊芋④稀莶、小飞蓬⑤苍耳⑥笔管草⑦苦苣菜⑧大刺儿菜。3.采用正交设计和均匀设计对苍耳SRAP-PCR反应体系进行了优化,并对2种设计方案优化出的最佳反应体系的可靠性和稳定性进行比较。通过实验比较,筛选出SRAP-PCR最佳反应体系为:2.5μl 10XPCR buffer、30 ng模板DNA、Mg2+ 2.5 mmol/L、dNTP 1.5 mmol/L、引物0.3μmol/L、Taq DNA聚合酶1U,总体积25μl,并得出均匀设计方案更适合SRAP体系的优化。扩增反应程序为:94℃预变性4 min;94℃变性45 s,35℃退火1 min,72℃延伸90 s,5个循环;94℃变性45 s,50℃退火1 min,72℃延伸90 s,35个循环;循环结束后,72℃延伸10 min。 4.采用SRAP技术对长白山区16份野生菊科植物进行遗传多样性及聚类分析,对60个SRAP引物组合的多态性进行筛选,得到10个条带清晰、稳定性好的引物组合,进行SRAP扩增,每个SRAP引物组合产生的清晰条带在10-16条不等,10个引物组合共产生117条带,平均每个引物产生11.7条,每个引物组合产生9-16条多态性带,10个引物组合共产生116条多态性带,平均每个引物组合产生11.6条多态性带,引物组合产生的多态性带的比例为99.14%。借助于NTSYS分析软件处理SRAP表型数据矩阵,计算各样品间的遗传距离,建立亲缘关系聚类树状图,进行遗传多样性和亲缘关系分析。依据此图得出:16份供试材料的GS的值在0.5128-0.7436之间,GS为0.635为阈值,可以分为3大类,第1类包括:苦荬菜、狼把草、小花鬼针草;第2类包括:牛蒡、苍耳、稀莶、大刺儿菜、菊芋、烟管蓟、艾蒿、地丁草、马兰花、小飞蓬;第3类包括:笔管草、苦苣菜、山莴苣。第2类在GS为0.68时又可以分为4小类:第(1)类:牛蒡;第(2)类:苍耳、稀莶、大刺儿菜、菊芋、烟管蓟、艾蒿;第(3)类:地丁草;第(4)类:马兰花、小飞蓬。当GS为0.73时可以将第(2)类分为3小类:①苍耳、稀莶②大刺儿菜、菊芋③烟管蓟、艾蒿。 5.根据RAPD和SRAP二元矩阵数据计算的遗传相似系数,按UPGMA法进行聚类分析,建立聚类图,将聚类结果和RAPD及SRAP的聚类结果分别与形态学的传统分类相比较分析,结果得出:RAPD标记技术在菊科中属间的分类研究中与形态学的传统分类差别较大;SRAP的聚类结果与传统分类相比较,基本比较吻合;综合聚类图得出的聚类结果与RAPD和SRAP聚类结果相比,其得出结果更为接近形态学传统分类,也可以间接证明SRAP分析比RAPD分析更稳定,准确。


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