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《延边大学》 2010年
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新孢子虫PO基因的真核表达及DNA疫苗的初步研究

贾文影  
【摘要】: 新孢子虫病(Neosporosis)是由犬新孢子虫(Neospora caninum)引起的一种世界范围流行、多种动物共患的原虫病,主要引发犬神经肌肉系统疾病及牛严重的繁殖障碍性疫病,孕牛频发流产、死胎、产弱胎等一系列临床症状,该病给畜牧业造成严重的经济损失。目前,还没有防制新孢子虫病的有效措施,一般认为疫苗免疫是预防牛流产和降低经济损失的可行性措施,因此,开发新疫苗已成为该领域研究热点。 新孢子虫核糖体磷蛋白PO (Ribosomal phosphoprotein PO, NcPO)可作为新孢子虫和刚地弓形虫之间的交叉反应性抗原,其抗体可抑制这两种虫体的生长。本试验采用PCR技术扩增出PO蛋白全长基因序列,并将其克隆入真核表达载体pVAX1中,构建pVAX1-NcPO表达质粒,分别进行PCR、双酶切及测序鉴定。用脂质体法将阳性克隆瞬时转染vero细胞,对转染细胞进行RT-PCR检测和IFA检测目的基因的转录与表达情况。结果表明克隆的PO蛋白基因序列全长为1379bp,构建的表达载体经鉴定无误。RT-PCR结果显示目的基因已被成功转录。IFA检测证明目的基因被成功表达。本试验成功构建了新孢子虫核糖体磷蛋白(NcPO)的真核表达载体,转染Vero细胞,获得了新孢子虫核糖体磷蛋白(NcPO)的瞬时表达。将大量提取并纯化的pVAX1-NcPO质粒添加佐剂免疫沙鼠,测定沙鼠的体液免疫和细胞免疫应答,以评价疫苗的免疫效果。 应用IFAT对免疫后沙鼠每周抗体效价进行测定,结果显示,Cp-M佐剂组、pVAX1-NcPO组的抗体效价均高于pVAX1空载体组和对照组,其中Cp-M组效价最高,攻毒后,Cp-M佐剂组、pVAX1-NcPO组比pVAX1空载体组和对照组抗体水平上升显著,Cp-M佐剂组、pVAX1-NcPO组分别与pVAX1空载体组和对照组差异极显著(P0.01)。 免疫沙鼠的细胞免疫测定分别采用检测T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+百分含量及淋巴细胞转化试验进行评估。结果显示疫苗Cp-M佐剂组、pVAX1-NcPO组的CD4+细胞含量均高于pVAX1空载体组和对照组,Cp-M组、pVAX1-NcPO组与pVAX1空载体组和对照组均差异极显著(P0.01),其中Cp-M佐剂组最高。 Cp-M组、pVAX1-NcPO组的CD8+细胞含量均高于pVAX1空载体组和对照组,Cp-M佐剂组与pVAX1空载体组和对照组差异显著(P0.05), pVAX1-NcPO组与pVAX1空载体组差异不显著。Cp-M组、pVAX1-NcPO组的CD4+/CD8'值均高于pVAX1空载体组和对照组,Cp-M组、pVAX1-NcPO组与对照组差异显著(P0.05),Cp-M组、pVAX1-NcPO组与pVAX1空载体组差异不显著。Cp-M组、pVAX1-NcPO组的CD4+/CD8+值均高于pVAX1空载体组和对照组,Cp-M组、pVAX1-NcPO组与对照组差异显著(P0.05), Cp-M组、pVAX1-NcPO组与pVAXl空载体组差异不显著。攻毒试验后经计算得出疫苗保护率分别为,Cp-M佐剂组70%,pVAX1-NcPO组66.7%。 本试验的结果显示新孢子虫DNA疫苗可以激活体液免疫和细胞免疫反应,具有一定的保护作用,并可为新孢子虫新型疫苗的研制提供参考。
【学位授予单位】:延边大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S852.723

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