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《延边大学》 2010年
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HGF诱导NSCLC细胞对吉非替尼耐药机制的研究

安昌善  
【摘要】: 吉非替尼是一种靶向抑制表皮生长因子受体(Epidermel Growth Factor Receptor, EGFR)的抗癌药物,为临床上应用的小分子EGFR酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor, TKI),可以靶向抑制非小细胞肺癌(non-small lung cancer, NSCLC)表达的EGFR,在治疗NSCLC的临床实践中取得了较满意的疗效。由于吉非替尼对特殊患者的选择性,实际上少部分NSCLC患者对吉非替尼有明显的疗效,大部分患者则无效或疗效差。吉非替尼敏感的患者主要是存在EGFR基因的突变,但EGFR基因突变的患者中不一定都对吉非替尼敏感。这是由于约25%-30%的EGFR基因突变者对吉非替尼原发性或获得性耐药,这种EGFR基因突变型患者对吉非替尼的耐药机制不十分清楚。 肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)是一种由间质细胞分泌的多功能因子,在体外促进多种细胞增殖和运动。部分肿瘤组织能表达HGF,与肿瘤细胞增殖、转移、侵袭有关。新近研究显示,肺癌组织中肿瘤编码基因MET扩增与对吉非替尼获得性耐药有关。有报道HGF诱导乳腺癌细胞对抗吉非替尼的生长抑制作用。对吉非替尼耐药的NSCLC细胞的EGFR基因型分两类,分别为EGFR突变型和EGFR野生型。我们选择了不存在EGFRT970M突变或MET扩增或KRAS突变等吉非替尼耐药相关因素,而且对吉非替尼敏感的NSCLC细胞EGFR突变型PC-9和EGFR野生型H292进行了研究。这两株细胞不存在EGFRT970M突变或MET扩增或KRAS突变等吉非替尼耐药相关因素。用HGF诱导这两株细胞,通过检测细胞增殖、周期及凋亡,观察是否对吉非替尼耐药,以及通过免疫印迹检测EGFR蛋白及MET编码的HGF的受体蛋白的表达,研究吉非替尼对非小细胞肺癌耐药的另一个途径的耐药机制,证实HGF/c-Met系统可作为治疗吉非替尼耐药的NSCLC的靶向位点,为临床提供吉非替尼联合c-Met抑制剂或HGF拮抗剂可能有效治疗耐药的NSCLC的理论依据。 MTT法检测PC-9和H292细胞增殖,作图法计算出药物半数抑制浓度(IC50); MTT法检测HGF诱导的PC-9和H292细胞增殖,利用exel文档画出药物浓度-生长曲线;实验分为4组:对照组(O)、肝细胞生长因子组(H)、吉非替尼组(G)、肝细胞生长因子+吉非替尼组(HG)。MTT法检测四组细胞存活率;细胞凋亡试剂盒(Annexin V/PE)染色和细胞周期试剂盒(PI)染色,利用流式细胞仪检测细胞凋亡和周期以及最后利用Multicycler 3.0软件分析细胞周期;比色法(Bradford法)为蛋白定量,利用蛋白质免疫印迹(Western bloting)技术检测细胞中c-Met、p-Met、p-EGFR蛋白的表达。 通过上述方法得到如下实验结果: 1、PC-9和H292均为吉非替尼敏感株,IC50分别为0.05±0.01μmol/L和0.17±0.05μmol/L。吉非替尼对PC-9和H292的生长抑制作用呈浓度依赖性,HGF (40ng/ml)诱导的吉非替尼浓度-存活率曲线均往右移,以H292的表现最为明显; 2、HGF(20ng/ml或40ng/ml)没有促进PC-9和H292增殖,但HGF(40ng/ml)和吉非替尼处理组(HG)与单纯吉非替尼处理组(G)相比有更高的存活率(P0.05),而且低浓度的HGF(20ng/ml)也能明显提高细胞的存活率(P0.05); 3、HGF (20ng/ml或40ng/ml)没有降低PC-9的凋亡率,而且吉非替尼促进HGF诱导(HG)的凋亡率与单用吉非替尼(G)比较没有差异(P0.05)。HGF (20ng/ml)能促进PC-9和H292的有丝分裂,但吉非替尼阻滞HGF诱导(HG)的G1期细胞周期比例与单用吉非替尼(G)比较没有差异(P0.05); 4、HGF (40ng/ml)诱导PC-9和H292增加表达c-Met的磷酸化。吉非替尼处理HGF (40ng/ml)诱导的PC-9和H292,H292有明显的p-Met的表达。吉非替尼能明显抑制HGF (40ng/ml)诱导PC-9增加表达的p-Met,但不能抑制HGF(40ng/ml)诱导H292增加表达的p-Met; 5、HGF (40ng/ml)诱导PC-9和H292增加表达EGFR的磷酸化。吉非替尼处理HGF (40ng/ml)诱导的PC-9和H292,H292仍有p-EGFR的表达,而PC-9没有p-EGFR的表达。吉非替尼能抑制HGF (40ng/ml)诱导PC-9增加表达的p-EGFR,但不能完全抑制HGF (40ng/ml)诱导H292增加表达的p-EGFR。 提示: 1、HGF可诱导敏感肺癌细胞PC-9和H292对吉非替尼耐药; 2、HGF诱导细胞凋亡及细胞周期影响可能与HGF诱导吉非替尼耐药无关; 3、HGF诱导PC-9和H292表达c-Met磷酸化和反式激活EGFR的磷酸化,可能是敏感肺癌细胞对吉非替尼耐药的重要机制; 4、吉非替尼能抑制HGF诱导EGFR突变型细胞表达的c-Met的磷酸化,不能抑制HGF诱导EGFR野生型细胞表达的c-Met的磷酸化。吉非替尼抑制HGF诱导c-Met的磷酸化可能与肺癌细胞基因类型相关; 5、吉非替尼完全抑制HGF诱导EGFR突变型细胞EGFR的磷酸化,不完全抑制EGFR野生型细胞EGFR的磷酸化。吉非替尼抑制HGF诱导EGFR的磷酸化可能与肺癌细胞基因类型有一定相关性; 6、HGF主要通过激活c-Met磷酸化诱导耐药,所以HGF/c-Met系统可作为治疗吉非替尼耐药的NSCLC的重要靶向位点; 7、HGF诱导c-Met磷酸化可能与吉非替尼原发性耐药相关,对EGFR突变的细胞来说吉非替尼能够阻断HGF诱导的EGFR和c-Met的磷酸化,所以同时应用HGF拮抗剂可能效果更佳;而对EGFR野生型的细胞来说吉非替尼不能阻断HGF诱导的c-Met的磷酸化,所以最好同时应用c-Met抑制剂或HGF拮抗剂可能带来更好的治疗效果,这为临床指导治疗NSCLC提供理论参考。
【学位授予单位】:延边大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R734.2

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【参考文献】
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