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《长春工业大学》 2010年
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A群链球菌胞内有效物质的提取纯化及其结构和活性的分析

白莹  
【摘要】:A群链球菌,为链球菌种属中的酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)。经青霉素处理后可以制成A群链球菌制剂,又名OK-432。它在临床的主要用途是作为生物反应调节剂(BRM)通过激活机体的免疫系统而参与肿瘤的联合治疗。 根据国内外多年的临床使用情况表明由于OK-432发挥作用的机制是激活免疫反应,因此它几乎适用于所有肿瘤,尤以消化系统肿瘤、呼吸系统肿瘤、妇科肿瘤、造血系统肿瘤等疗效更显著。 但是,到目前为止,A群链球菌的功能成分、抗肿瘤机理尚不十分明确,严重影响了A群链球菌制剂在临床上的应用。本文利用现代化分析测试手段,分析A群链球菌成分和化学组成,提取纯化A群链球菌的活性成分,对纯化后得到的物质的纯度进行鉴定,同时对其结构、化学性质及体外抗肿瘤活性进行了研究。实验研究结果如下: 第一部分:A群链球菌胞内主要成分分析与检测。本论文对A群链球菌中各营养成分组成及含量进行了系统的研究,分析结果表明,A群链球菌胞内的主要成分是脂磷壁酸,其中磷含量为24.41mg/mL。虽然有蛋白和多糖的存在,蛋白纯化后测定其分子量在25-33KD。但是蛋白和多糖的含量很低,仅分别为0.057mg/mL和10mg/mL。因此,脂磷壁酸为A群链球菌去壁后胞内的主要成分。 第二部分:A群链球菌中脂磷壁酸的提取纯化。本论文使用不同方法提取A群链球菌中的脂磷壁酸,然后分别采用离子交换柱层析(DEAE-52)和凝胶柱层析(Sepharose-CL-4B)对其进行纯化,然后紫外全波长扫描对纯度进行鉴定,并就抑菌活性进行对比分析。结果证明:阴离子交换层析分离曲拉通TX114提取的LTA1,能够较好地使LTA1从曲拉通TX114中分离出来,紫外扫描后发现无显著蛋白质及核酸污染。阴离子交换层析分离曲拉通TX114提取的LTA1和Sepharose-CL-4B疏水色谱法提纯后的LTA2对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有良好的抑菌活性,而且效果无显著差异。但Sepharose-CL-4B疏水色谱法的优点在于它不依赖于负电荷或特定结合的寡糖结构,因而适用范围更广 第三部分:脂磷壁酸的结构和活性分析。本论文主要将Sepharose-CL-4B纯化得到的LTA2进行结构分析和活性的研究,Sepharose-CL-4B疏水色谱法提纯后的LTA2与标品LTA具有相似的结构。LTA2一系列成分分析测定得知LTA提取率在15%左右。因此,进一步证明冷酚法提取并通过凝胶色谱层析能够得到纯度较高的脂磷壁酸。气相色谱测定A群链球菌中脂磷壁酸的脂肪酸和单糖的组成,结果显示LTA2中含有五种脂肪酸,其主要的脂肪酸为C12:0,C6:0和C8:0;仅含有葡萄糖一种单糖组分。 用MTT法检测不同浓度的脂磷壁酸对子宫颈癌细胞Hela在不同时间点的抑制作用。活性试验证明LTA2对Hela细胞的抑制作用有显著性差异,在一定剂量范围内,脂磷壁酸对Hela细胞增殖具有抑制作用。
【学位授予单位】:长春工业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R915

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【参考文献】
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