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《吉林农业大学》 2011年
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框镜鲤原代细胞培养和锦鲤疱疹病毒的分离鉴定

朱霞  
【摘要】:锦鲤疱疹病毒病(KHVD)的暴发给鲤鱼养殖业造成了严重的经济损失,KHVD有效疫苗的研制迫在眉睫,锦鲤疱疹病毒(KHV)的分离是预防和控制本病的关键,而建立敏感细胞系是分离KHV的前提。本文以框镜鲤(Cyprinus carpio var. specularis)为实验材料,取吻端和尾鳍组织,采用组织块培养方法进行体外培养,建立和优化框镜鲤细胞体外培养的最佳条件,研究框镜鲤吻端和尾鳍组织在体外培养环境下的部分细胞特性,并分别将其传代细胞命名为MSC和MFC。同时,利用培养的MSC和MFC进行了KHV的分离。 框镜鲤吻端和尾鳍组织在不同培养基(MEM、DMEM、RPMI1640、M199)、血清浓度(5%、10%、15%、20%)和温度(20℃、26℃、30℃、37℃)下启动原代培养,通过对细胞迁出距离绘制生长曲线以及细胞迁出距离的均值间多重比较,结果表明,含有20%血清的M199,在26℃~30℃下培养,最适合吻端和尾鳍组织细胞的迁出和增殖。两种组织,培养3d即可有细胞迁出,并逐渐在组织块周围形成细胞单层,即生长晕,一个月左右细胞单层可长满70~80%,可用于传代培养。MSC和MFC传至第3代时可适应体外环境,且MSC活性好于MFC细胞;H.E.染色发现,MSC细胞着色比MFC细胞深,MSC多为纤维样细胞,而MFC多为上皮样细胞,两种细胞增殖迅速,均具有建立连续细胞系的潜力;以10%DMSO为冻存保护剂,分别冻存于-80℃和液氮中,结果显示液氮冻存细胞的复苏存活率低于-80℃冻存,MFC的存活率略高于MSC。通过病毒敏感性试验表明SVCV可以感染MSC和MFC,产生典型的CPE,并且可以显著提高病毒滴度。 本文利用上述培养的MSC和MFC细胞进行KHV分离,通过将正常细胞单层与患病鱼的肾细胞共培养,5-6d后出现典型的CPE,即细胞体积增大并出现细胞质空泡化;在电镜下可观察到典型的KHV病毒粒子,命名为KHV-cj;应用PCR方法扩增获得ORF25基因的849bp DNA片段,连接至pMD18-T载体中,经酶切鉴定后序列分析表明,与GenBank登录的三株KHV同源性均为99%,基因进化比较显示,与KHV-J株关系较近。将病毒培养物(TCID50效价为10-6.75)腹腔注射接种实验鱼可使其100%发病,并且症状和病理变化与自然感染KHV的鱼一致,死亡率为75%。表明本研究在国内首次分离到KHV。
【学位授予单位】:吉林农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S943

【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
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【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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【共引文献】
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中国重要会议论文全文数据库 前7条
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中国博士学位论文全文数据库 前10条
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中国硕士学位论文全文数据库 前10条
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【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前9条
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中国硕士学位论文全文数据库 前1条
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3 朱霞;框镜鲤原代细胞培养和锦鲤疱疹病毒的分离鉴定[D];吉林农业大学;2011年
4 李俊超;锦鲤疱疹病毒诱导的细胞凋亡与抗病毒药物筛选[D];华中农业大学;2014年
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9 王璐;江苏地区鲫出血病病原的分离、鉴定及检测方法研究[D];南京农业大学;2012年
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