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《吉林农业大学》 2011年
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H1N1型猪流感病毒血凝素HA1重组乳酸菌的制备和免疫保护效果研究

赵洪梅  
【摘要】:猪流感是由猪流感病毒引起的一种猪的急性、高度接触性呼吸道传染病,其传播迅速,给养猪业造成重大的经济损失。为了更好的控制和预防猪流感,研制出猪流感疫苗是当务之急。血凝素是构成SIV囊膜表面的结构糖蛋白,是一种保护性抗原,具有良好的免疫原性,在SIV侵染过程中起着识别细胞受体中的作用。本研究将猪流感血凝素HA1基因克隆出,构建重组表达质粒并检测其在大肠杆菌和乳酸菌中的表达,再将重组菌免疫鼠,检测其免疫保护效果。具体研究的内容和结果如下: 1.H1N1猪流感病毒HA1基因的原核表达载体的构建及重组乳酸菌的制备 根据Genbank登陆的SIV HA1基因序列信息设计一对包含HA1基因开放阅读框的引物,上下游分别引入NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点。用PCR扩增猪流感病毒HA1基因,全长1035bp,经阳性克隆菌抽提质粒进行酶切,同时对PSIP409进行了酶切,将两者回收后连接并转化DH5α筛选阳性菌落进行SppIP诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot检测,可见在37.95KDa处有明显的目的性蛋白条带,推测HA1基因在大肠杆菌中获得了表达。然后将其重组质粒PSIP409-HA1电转化到Lb.plantarum NC8,通过质粒提取、限制性内切酶酶切、PCR鉴定等方法鉴定筛选出的阳性菌落进行SPPIP诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot检测,可见在37.95KDa处有明显的目的性蛋白条带,推测HA1基因在乳酸菌中获得了表达。 2.重组乳酸菌免疫小鼠以及免疫保护效果的检测 6-8周龄小鼠分为3组,第一组PBS灌胃200μL;第二组用空载体表达的乳酸菌灌胃200μL(1×108)第三组用重组乳酸菌灌胃200μL(1×108),每组15只,先免疫2周,然后用病毒攻击,观察一周,在这期间,计算小鼠的成活率和增重率,杀死小鼠,眼球采血,分离血清,用HI和ELISA测定血清中抗体水平;取肺和气管,做病理切片,检测呼吸系统受损坏的程度;从脾脏和淋巴结中分离CD4+、CD8+ T细胞、CD11c+DC、CD19+B细胞、IL-12、IFN-γ用流式细胞仪测定各细胞因子的表达水平。结果显示,重组乳酸菌组的成活率、增重率、抗体水平明显高于其他两组,差异显著,各细胞因子表达水平也明显增高。以上结果表明,HA1基因在植物乳杆菌NC8中获得了表达,重组乳酸菌增强了免疫细胞的表达,为研制预防猪流感的重组乳酸菌疫苗奠定了试验基础。
【学位授予单位】:吉林农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S858.28

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