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《吉林农业大学》 2011年
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荞麦中β-葡萄糖苷酶的分离提取及其酶促动力学的研究

张卓  
【摘要】:β-葡萄糖苷酶是纤维素酶的重要组成成分,它广泛的存在于动植物、微生物界。该酶具有参与纤维素材料的生物转化,水解纤维素二糖为葡萄糖;作为食品风味酶水解风味前体,释放风味物质(如萜烯醇类化合物);帮助多酚(如:花青素、黄酮、异黄酮等)葡萄糖苷转化为游离多酚,以提高多酚的生物活性或者帮助分离多酚等功能。 本研究通过对荞麦中β-葡萄糖苷酶的分离提取纯化后,继而对β-葡萄糖苷酶进行酶促动力学的研究,为荞麦中β-葡萄糖苷酶的进一步应用打下基础。 研究结果表明:(1)荞麦中β-葡萄糖苷酶的提取条件的确定:通过对β-葡萄糖苷酶提取条件的正交实验,得到荞麦中β-葡萄糖苷酶的最佳提取条件为:浓度为0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液,pH值为4.6,离心转速为5000 r/min,提取得到的β-葡萄糖苷酶活性浓度为597.96×106U/L,该酶的比活力为0.397×106U/mg。 (2)荞麦中β-葡萄糖苷酶的分离纯化过程中,经过初步提取的酶液通过盐析法-硫酸铵盐析分级沉淀法来进一步分离。通过分级沉淀实验确定了最佳盐析范围在硫酸铵饱和度为30~45%,在此范围内时,分级沉淀得到的酶的比活力为0.66×106U/mg。 (3)经盐析沉淀得到的酶液,通过透析袋进行透析过夜,从而除去多余的盐类,并且对酶液进行浓缩,此时分离纯化得到的酶的比活力为0.91×106U/mg。 (4)分离纯化透析后的酶液,再经葡聚糖凝胶SephadexG-150的分离纯化,得到两个较高酶的比活力区间,酶的比活力分别是1.87×106U/mg和1.78×106U/mg。 (5)将得到较高酶比活力的区间中的样品,进行分子相对质量的测定,得到两个条带,分别是46.5kDa,51.6kDa。 (6)通过从荞麦中分离提取纯化出了β-葡萄糖苷酶后,对每步提取分离步骤进行了,提纯倍数的计算,结果如下:经最佳盐析范围纯化后的酶,此时酶的提纯倍数为1.66,透析以后酶的提纯倍数2.29,葡聚糖凝胶过滤酶的纯化倍数为4.71。 (7)得到纯化后的β-葡萄糖苷酶样品,进行酶促动力学的研究,研究结果如下: ①酶促动力学的参数,米氏常数Km和Vmax通过米氏方程的双倒数形式来测定,根据Lineweaver-Burk双倒数法作图,可以得到方程y=0.6183x+0.4948,R2=0.9938,且Km为1.25 mmol/L,Vmax为2.02 mmol/min。 ②荞麦中β-葡萄糖苷酶的酶促反应最适温度为50℃;该β-葡萄糖苷酶的热稳定性研究表明温度40℃以下时稳定性较高。 ③荞麦中β-葡萄糖苷酶的酶促反应最适pH值为5。通过对该酶的pH稳定性研究表明,在pH值为5时,相对酶活力达到最大,当pH值5时,随着pH值的逐渐降低,pH值对β-葡萄糖苷酶稳定性的破坏也逐渐增加。 ④荞麦中β-葡萄糖苷酶底物浓度对酶促反应的研究结果表明,当底物pNPG的浓度1mmol/L时,酶的反应速率随底物pNPG浓度的增加而呈快速线性提高,表现为一级反应特征;当底物pNPG的浓度在1 mmol/L~5 mmol/L时,酶的反应速率随底物pNPG浓度的增加而呈缓慢线性提高;当底物pNPG的浓度5 mmol/L后,底物pNPG的浓度对酶的反应速率无显著影响,表现为零级反应。此研究结果符合中间产物学说。 ⑤研究激活剂的激活作用过程中,激活剂维生素C浓度在4 mmol/L时,相对比活力最高。金属离子激活剂Mg2+对β-葡萄糖苷酶有促进作用,其他Na+、Ca2+金属离子对该酶没有明显的促进作用。激活剂对该酶促反应具有促进作用。 ⑥研究抑制剂的抑制作用过程中,加入抑制剂Ag+,通过双倒数法作图,得到的米氏方程为y=2.1827x+0.4948,R2=0.9972,其中Km为4.41 mmol/L,Vmax为2.02 mmol/min。通过加入抑制剂与未加入抑制剂的米氏方程和酶促反应参数之间比较,得到了抑制剂Ag+对该酶的酶促反应抑制作用类型为竞争性抑制作用。
【学位授予单位】:吉林农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S517

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【参考文献】
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