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《吉林农业大学》 2011年
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火红密孔菌发酵产漆酶培养基的优化、分离纯化及其应用的初步研究

张田田  
【摘要】:漆酶(benzenediol:oxygen oxidoreductases; EC 1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶,最早发现于日本漆树的分泌物中,与植物抗坏血酸氧化酶、哺乳动物血浆铜蓝蛋白同属铜蓝氧化酶家族。漆酶主要分布于高等植物和真菌中,分为漆树漆酶和真菌漆酶两大类。漆酶的作用底物非常广泛,能催化多种酚类化合物和大量含有羟基、酸基或氨基等基团的其他类化合物的氧化。因其较强的氧化还原能力,漆酶在造纸工业、食品工业、生物检测、生物合成等领域具有较大的应用价值和潜力。 本文对火红密孔菌(Pycnoporus sanguineus (Fr.) Murr.)发酵产漆酶的营养条件、漆酶的分离纯化及酶学性质、漆酶对不同种类染料的脱色作用进行了研究,主要结果如下所示: 利用Plackett-Burman试验设计筛选出影响产酶的三个主要因素,即麦麸、葡萄糖和蛋白胨。在此基础上用最陡爬坡试验逼近最大响应区域,再利用Box-Behnken试验设计及响应面分析法进行回归分析,通过求解回归方程得到优化发酵培养基为:麦麸2.5%,葡萄糖2.0%,蛋白胨1.2%,pH自然。此时,漆酶活力达到最大值330.66U/mL,与初始设计发酵培养基(238 U/mL)相比漆酶活力提高了38.9%。 火红密孔菌漆酶存在于发酵液离心后的沉淀中,且溶解性较差,利用0.1mol/L NaOH溶液溶解漆酶沉淀时,上清中漆酶活力回收率达72.1%。溶解漆酶经透析、浓缩、葡聚糖凝胶层析后得到电泳纯的漆酶,纯化倍数为1.94,回收率为19.53%。 火红密孔菌粗漆酶的一般稳定性较好,4℃存放60d,残余活力为24.5%;粗漆酶在醋酸缓冲液和磷酸缓冲液两个缓冲液pH范围内各自有其最适pH值,分别为5.2和6.4,漆酶在中性偏碱条件下较稳定,pH 5.8~8.0条件下保温12h的残余酶活均在80%以上;最适反应温度为40℃,60℃以下保温50min均能保存80%以上的活力,温度稳定性较好;Zn2+对火红密孔菌漆酶有明显的促进作用,Co2+、Ca2+对火红密孔菌漆酶有轻微的抑制作用,Al3+、Ba2+、Na+、Mg2+的抑制作用则较明显;以邻联甲苯胺为底物时,测得该酶的Km值为0.772mmol/L。 火红密孔菌漆酶在未添加任何小分子介体的条件下对蒽醌染料茜素红、偶氮染料甲基红和三芳基甲烷染料溴甲酚绿均具有脱色作用。粗漆酶对染料的降解时间以8h为宜,之后增幅趋于平缓;最适脱色温度为30℃,随着温度的升高,脱色率逐渐降低;pH对三类染料脱色率的影响较为复杂,最大吸收波长随pH改变而发生红移或蓝移;随着漆酶初始浓度(活力)的增加,其对染料的脱色率也增加,初始浓度为75.68U/mL时达到最大脱色率,之后增幅缓慢。
【学位授予单位】:吉林农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:TQ925

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【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
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【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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