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土壤中产琥珀酸菌株的筛选、鉴定及发酵特性研究

周文雨  
【摘要】:琥珀酸作为一种重要的平台化合物,被广泛应用于食品行业、农业、医药和化工生产,具有广泛的应用价值。至今,化学方法合成琥珀酸不仅繁琐昂贵,而且危害环境,从而限制了琥珀酸的广泛应用。与传统方法相比,发酵法生产琥珀酸廉价、环保、而且节约资源,因此利用微生物发酵生产琥珀酸是绿色、更具有发展潜力的方法,它为琥珀酸的生产打开了新的局面。而菌种在发酵法中是很重要的因素,是决定发酵整个过程的关键。目前产琥珀酸微生物的筛选成为研究的热点,研究较多的微生物主要集中在产琥珀酸厌氧螺菌,产琥珀酸放线杆菌,大肠杆菌和曼海姆琥珀酸产生菌等。 本研究通过富集培养和溴甲酚绿快速筛选平板的结合筛选,从土壤中分离出能够产琥珀酸的菌株,并进行相关生理生化鉴定和分子遗传学鉴定,对该菌的生长和发酵特性进行初步研究。主要研究结论如下: 1、本研究采用选择性较强的富集培养基结合溴甲酚绿快速筛选平板,从土壤中筛选、分离出80株产酸的菌株,利用TLC法和荧光法分离出13株具有不同产琥珀酸能力的菌株,并进一步利用HPLC法定性、定量,复筛得到5株发酵性状较优菌株,其中一株JLT9琥珀酸累积产量达6.01g/L。 2、对筛选出具有产琥珀酸能力的菌株进行鉴定研究。综合JLT9菌株的形态学和生理生化反应结果,由《伯杰细菌鉴定手册》初步进行鉴定,该菌可能属于肠杆菌属。提取菌体总DNA,以细菌通用引物p1、p2对该菌株进行PCR扩增,获得1441bp序列,该序列经BLAST比对分析,绘制无根进化树,结果表明,JLT9与AF395913.1最为接近,AF395913.1为肠杆菌Enterobacter aerogenes,比对结果AF395913.1与JLT9序列相似性为99%,经分子生物学判断,最后确定本试验筛选的细菌类型为肠杆菌。 3、菌株JLT9的生长曲线表明,在菌株接种后2小时处于生长延滞期,菌体生长缓慢,代谢较弱;菌体生长2-12h进入对数生长期,此时菌株的代谢功能及其活跃,菌体浓度显著增加;12h以后菌体处于稳定生长期,随着菌体密度的增大,增值速度逐渐下降,菌体生长速度缓慢,最终进入衰亡期。菌株JLT9发酵过程中,每隔2h对发酵液pH值和消耗NaOH标准溶液的量进行测定,绘制曲线。由曲线可以看出pH值的变化在菌体对数生长期较为显著,说明主要产酸是在对数生长期;发酵液消耗NaOH标准溶液的量在发酵初期,即在对数生长期产酸较多。通过测定发酵液pH值和消耗NaOH标准溶液的量都可以得出,琥珀酸的产生是在对数生长期完成的,进入平稳期之前是产品收获最佳时间。


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