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《吉林农业大学》 2011年
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纤维素酶高产菌的诱变选育及其酶学性质的研究

徐杨  
【摘要】:纤维素类物质是自然界中含量最丰富、最廉价的可再生资源。据测算,地球表面每年因光合作用合成的干物质高达1500亿吨的干物质,其中纤维素、半纤维素的总量约为850亿吨,而纤维素的含量约占总干物质的6%,达220亿吨。可见,纤维素是自然界中取之不尽、用之不竭的可再生资源。纤维素酶是指能催化水解β-1.4葡萄糖苷键生成纤维二糖和葡萄糖的一类酶的总称,纤维素酶不是单一的酶,是由多个水解酶组成的一类复杂酶系。目前,在纤维素的分解转化的研究中,对纤维素的研究主要集中在纤维素水解转化的微生物的诱变、.筛选上,纤维素酶活性的提高。本论文以绿色木霉AS3.3711作为出发株,分别利用紫外线、快中子、γ射线、硫酸二乙酯和亚硝酸钠五种诱变因子,诱变选育纤维素酶高产的菌株,并且对其酶学性质进行了研究,结果如下: 1.采用五种不同的诱变方法对绿色木霉AS3.3711进行诱变选育,通过诱变致死率在70%~80%范围内作为筛选依据,试验结果如下: (1)亚硝酸钠诱变:在菌悬液中分别加入醋酸缓冲液以及0.1mol/L, 0.05 mol/L, 0.03 mol/L, 0.02 mol/L等不同浓度的亚硝酸钠溶液,室温下分别保温5,10,15,20min,稀释涂布在刚果红筛选培养基上初筛,再以摇瓶发酵复筛,得到亚硝酸钠诱变的最佳浓度为0.1mol/L,诱变时间为20min,突变株的CMC酶活是出发菌株酶活的1.74倍。 (2)硫酸二乙酯诱变处理:在硫酸二乙酯与菌液的体积比为1%,0.5%,0.3%,0.2%,30℃条件下分别振荡处理20,30,40,60min。稀释涂布在刚果红筛选培养基上初筛,再以摇瓶发酵复筛,得到硫酸二乙酯诱变的最佳体积比为1%,诱变时间为40min,突变株的CMC酶活为出发菌株的2.8倍。 (3)紫外线辐照诱变:分别在256nm和354nm处,垂直距离为20,25,30cm,辐照处理60,120,180,240,300,360,600s,稀释涂布在刚果红筛选培养基上初筛,再以摇瓶发酵复筛,得出紫外线最佳诱变条件:紫外波长为354nm,垂直距离30cm,照射时间240s,突变株的CMC酶活为出发菌株的2.64倍。 (4)γ-射线诱变:以照射剂量率为0.4Gy/min,照射时间为2.5,3.75,5,6.25,10min,将处理后的菌液稀释涂布在刚果红筛选培养基上初筛,再以摇瓶发酵进行复筛,酶活提高最多的为出发菌株的1.29倍。 (5)快中子辐照诱变:采用剂量率为0.002Gy/s,分别照射5,10,20,30,40min,即0.6,1.2,2.4,3.6,4.8Gy 5个剂量进行处理,稀释涂布在刚果红筛选培养基上初筛,再以摇瓶发酵复筛,得出当辐照剂量为1.2Gy时,正突变率为14.3%,筛选和连续传代培养,获得了稳定性较好的正突变株Fn10-1。突变株Fn10-1的羧甲基纤维素酶活(CMC酶活)可达914.80 U/mL,比出发菌株提高了30倍,滤纸酶活(FPA酶活)为633.63 U/mL,比出发菌株提高了4倍。 2.采用不同饱和度硫酸铵溶液对粗酶液进行盐析沉淀,当硫酸铵饱和度为80%时,盐析沉淀获得的纤维素酶的酶活力为原酶活的97.8%,即894.6U/mL。 3.对突变株Fn10-1所产纤维素酶进行酶学性质研究,包括酶促反应的最适pH值、pH稳定性、最适温度、热稳定性、激活剂和抑制剂。结果如下:纤维素酶的最适pH值为7.6,在pH值5.6-7.6之间有较好的稳定性,剩余酶活为原酶活的91.%;最适温度为70℃,并且在50℃以下,保温400min,剩余酶活为保温前的92%; Mg2+、Co2+、Na+、Mn2+、Fe2+、Al3+对该酶具有明显的激活作用,而Ba2+、Ag2+、Cu2+、K+对该酶具有明显的抑制作用。
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