重组鸡痘病毒rFPV-F-VPO实时荧光定量PCR检测方法的建立和应用

【摘要】：重组病毒活载体疫苗是基因工程疫苗的一种,以痘病毒为载体构建活载体疫苗,是基因工程疫苗研究的一大热点。重组痘苗病毒载体仍然保持了野生型痘苗病毒的特性,几乎可以感染所有源于哺乳动物的培养细胞,并且可以表达外源蛋白。与其他表达载体相比,具有较高的表达效率,因此,可以用痘病毒载体构建禽类的基因工程活载体疫苗,也可作为非复制型病毒载体来开发哺乳动物基因工程活载体疫苗,具有很大的发展潜力。鸡痘病毒是痘病毒中常用的一种表达载体,通过基因工程的手段,构建的重组鸡痘病毒载体可以稳定表达多种病毒的保护性抗原基因。重组鸡痘病毒载体可以同时插入不同的外源基因进行各自表达,而且各基因表达彼此不受干扰,可以用来构建多价疫苗和多联疫苗。由于它载体容量大,表达效率高,已经受到越来越越多研究者的青睐。 外源基因在宿主细胞染色体上的整合效率,影响重组蛋白的表达。传统检测和分析组织或细胞中外源基因表达水平的方法,不能满足当今迅速发展的科研需要。荧光定量PCR技术,是近年来应用很广泛的一项新的检测技术,可以动态检测PCR扩增的全部过程,自动分析检测数据,不用对PCR的产物进行处理可以在很短的时间内,可以在较短的时间内精确定量外源基因的表达水平。 将重组鸡痘病毒rFPV-F-VPO,在CEF细胞中连续传代培养20代,并提取1、5、10、15、20代次重组病毒的基因组,利用所建立的实时荧光定量PCR检测方法,并依据rFPV-F-VPO外源基因序列设计并合成特异性引物,并构建制备标准DNA模板。采用荧光染料SYBR GreenⅠ的方法,用梯度稀释的标准模板制作标准曲线,然后依据所建的标准曲线,计算分析各代次重组病毒的拷贝数,分析外源基因在各代次重组病毒中的表达情况。最后将重组鸡痘病毒rFPV-F-VPO,接种于SPF鸡,在不同的时间段取其心、肝、脾、肺、肾组织器官,利用所建立的real-time PCR方法,检测分析重组鸡痘病毒活疫苗在鸡体内的动态分布规律,为说明重组鸡痘病毒的免疫机理和下一步的临床应用研究提供了理论基础。 结果分析显示所建立的标准曲线,具有良好的重复性,特异性高,敏感性强。模板的量和Ct值呈现良好的线性关系,相关系数高为r2=0.998,扩增效率E=97.2%。溶解曲线呈现单一峰,没有出现非特异性的扩增,熔解温度在84±1℃。根据所建立的标准曲线,计算分析各代次重组毒外源基因拷贝数,结果表明重组鸡痘病毒rFPV-F-VPO的F基因和VPO基因,在各代次细胞中的表达水平并不相同,在鸡体内不同的时间表达水平和不同组织器官的分部情况也不相同。