结核分枝杆菌T淋巴细胞结合短肽克隆的全细胞差减筛选

【摘要】：研究目的：以T淋巴细胞为靶标对结核分枝杆菌噬菌体随机肽库,进行3轮全细胞差减筛选,期望获得与T淋巴细胞特异性结合的短肽,为寻找能够激活T淋巴细胞的活性肽,进而为开发相应的结核病新型多肽疫苗提供一些实验依据。 研究方法：利用尼龙毛柱法分离小鼠的T淋巴细胞,以结核分枝杆菌H37Rv免疫Balb/c小鼠的T淋巴细胞为靶细胞,以生理盐水注射的Balb/c小鼠的T淋巴细胞为阴性吸附细胞,对结核分枝杆菌噬菌体随机肽库进行3轮全细胞差减筛选,在第一、二、三轮筛选中,结核分枝杆菌噬菌体随机肽库与免疫组T淋巴细胞的孵育时间分别为2h、1.5h、1h；与正常细胞孵育时间分别为2h、2.5h、3h；洗脱液的浓度分别为1%、3%、5%。蓝白斑筛选阳性克隆,提取纯化阳性克隆的单链DNA进行电泳鉴定,并观察阳性克隆对小鼠淋巴细胞转化的影响。 研究结果：结核分枝杆菌H37Rv免疫的Balb/c小鼠血清抗PPD IgG水平在第六周时达到1：3200；第2周、第4周、第6周的对照组和免疫组之间差异显著(p0.05)；除笫2周差异不极显著外、第4周、第6周的对照组和免疫组之间差异极显著(p0.01),抗体水平的增加说明已成功获得免疫小鼠。尼龙毛柱分离T淋巴细胞的回收率为30%,活细胞比率为93%,得到了高活力的T淋巴细胞。3轮全细胞差减筛选后噬菌体得到了富集,噬菌体的回收率从4.0×10-55增加到52,获得的阳性克隆滴度为1.3×104/ml。蓝白斑筛选得到了阳性克隆,阳性克隆单链DNA电泳条带一致。阳性克隆对免疫组T淋巴细胞转化的影响明显大于其他刺激物,其刺激指数最大为3.5。 结论：成功利用尼龙毛柱分离到T淋巴细胞,其回收率为30%,活细胞比率为93%；3轮全细胞差减筛选后获得了阳性克隆,阳性克隆滴度为1.3×104/ml；阳性克隆能够有效刺激T淋巴细胞活化。