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《吉林农业大学》 2015年
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鸭源禽流感病毒的分离鉴定及其聚合酶活性研究

王军政  
【摘要】:AIV分为多种血清亚型,目前已鉴定出有17种HA亚型和10种NA亚型。几乎所有亚型的AIV都可以感染禽类,能感染人的AIV主要为H1、H3、H5、H6、H7、H9和H10亚型,其中以H5亚型最为常见。由于宿主范围的限制,AIV很少感染人类。然而,近年来禽流感H5N1亚型造成人类感染的病例却不断增加。虽然到目前为止,持续的AIV感染人类的病例尚未见报道,但在环境和机体免疫的选择压力下,禽流感H5亚型的适应性突变和不断的抗原漂移现象,可能导致其跨越物种屏障,实现在人群中传播。因此,加强对新发H5亚型AIV致病性和传播力的研究,对防控AIV的大规模传播具有至关重要的作用。本研究采集病死鸭病料,常规处理后接种于10日龄SPF鸡胚,收取24-96h内死亡鸡胚尿囊液,进行血凝和血凝抑制实验、核酸鉴定及HA和NA基因序列分析。结果表明,该分离株为H5N5亚型,命名为A/Duck/Changchun/01/2010。HA和NA基因进化分析显示,该毒株属于新型H5N5流感病毒2.3.2.1系,主要在东亚地区流行。该研究结果为进一步研究鸭源H5N5禽流感病毒的分子进化提供了重要信息。为进一步研究该分离毒株的进化特点,设计并合成扩增核蛋白(NP)基因、聚合酶蛋白(PB2、PB1、PA)基因的特异性引物,对核蛋白(NP)、聚合酶蛋白(PB2、PB1、PA)RNA进行反转录,并进行PCR扩增,获得分离毒株PB2、PB1、PA、NP基因序列。同时利用生物信息学软件或在线分析软件分析其信号肽、跨膜区和疏水性,并预测潜在的糖基化位点和磷酸化位点。对比分析后发现,该毒株与我国南方水禽主要流行的AIV同源性较高。禽流感病毒PB2基因的第627位氨基酸和第701位氨基酸对于AIV跨种间传播起到重要作用,为了解该病毒聚合酶活性及PB2基因的第627位氨基酸和第701位氨基酸突变后引起聚合酶活性变化情况。利用点突变技术,针对实验中测定的聚合酶基因序列设计酶切位点,对四个质粒进行双酶切,将酶切后的产物与表达载体进行连接,连接后分别对PB2基因的1879位和2101位碱基进行点突变,使禽流感病毒PB2基因第627位氨基酸由谷氨酸突变为赖氨酸,第701位氨基酸由天冬氨酸突变为天冬酰胺。将聚合酶蛋白转染到293T细胞中,通过检测荧光活性值报告病毒聚合酶复合体的活性。结果表明,禽流感病毒A/duck/changchun/01/2010的聚合酶蛋白荧光值较低,PB2基因2101位碱基突变对聚合酶蛋白活性影响不大,PB2基因1879位碱基突变能提高聚合酶蛋白活性,两个碱基同时突变聚合酶蛋白活性明显提高。
【学位授予单位】:吉林农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:S852.65

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