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《吉林农业大学》 2017年
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红花天冬氨酸代谢途径关键酶CtDHDPS基因的克隆、表达分析及功能研究

张玲  
【摘要】:红花(Carthamus tinctorius L.)在我国具有悠久的栽培历史,为菊科一年生草本植物,可作为药材、油料、饲料、染料等,具有消炎镇痛、改善微循环、活血化瘀、抗氧化等药理作用。红花种子中含有多种必需氨基酸,近年来红花的饲用价值已经得到了学者的重视,但是,红花种子中的必需氨基酸含量较低,达不到动物饲料的标准,如何提高红花种子中必需氨基酸的含量已迫在眉睫。天冬氨酸代谢途径是植物体内合成赖氨酸等必需氨基酸的主要途径,二氢吡啶二羧酸合酶(dihydrodipicolinate synthase,DHDPS)是赖氨酸合成的最重要的关键酶之一。通过对Ct DHDPS基因的分离和功能鉴定,提高红花种子中必需氨基酸的含量目前国内外尚未见相关研究报道。本研究在克隆得到红花二氢吡啶二羧酸合酶(Ct DHDPS)基因全长的基础上,构建了Ct DHDPS基因的植物超表达载体,转化模式植物拟南芥,对转基因拟南芥阳性植株进行代谢产物含量分析,为Ct DHDPS基因在天冬氨酸代谢途径中的作用机制研究奠定了理论与试验基础;对Ct DHDPS基因及其突变体进行了原核诱导表达,为筛选获得高酶活性的Ct DHDPS提供了蛋白,为培育高必需氨基酸含量的红花新品种提供了新的思路。主要研究成果如下:(1)根据红花转录组文库注释信息获得Ct DHDPS基因的中间序列,通过RT-PCR与RACE技术从红花种子中克隆得到Ct DHDPS基因全长c DNA序列。(2)对Ct DHDPS基因进行了生物信息学分析,并研究其在不同发育时期红花籽粒中的表达量。结果表明:该基因在红花不同发育时期种子中的表达量呈先升高后降低又骤然上升再下降的趋势,开花后12天种子中表达量最低,在开花后14天表达量最高。(3)采用传统分子克隆及DNA重组技术构建p Basta-Ct DHDPS植物超表达载体。采用Flora Dip法侵染野生型拟南芥,对所获得的43株T2代抗性植株种子进行基因组PCR检测,经1%琼脂糖凝胶电泳检测,结果显示有31株为阳性植株,说明CtDHDPS基因已转入拟南芥中。(4)对T3代转基因拟南芥植株的种子进行总游离氨酸含量的测定,结果表明,转Ct DHDPS基因的拟南芥种子中总游离氨基酸含量均较野生型拟南芥高,最高可达到5.51倍,说明Ct DHDPS基因可以有效调控总游离氨基酸的生物合成。(5)将红花DHDPS基因与p EASY-E1载体相连,构建p EASY-E1-Ct DHDPS原核表达载体。获得了34.75KD大小的蛋白,说明Ct DHDPS基因可以成功在大肠杆菌中表达;并且对Ct DHDPS基因的第379位与第382位进行氨基酸的定点突变,而突变后的基因型在大肠杆菌中成功得到表达,且所表达的蛋白大小与Ct DHDPS蛋白大小一致。为后续该基因编码的二氢吡啶二羧酸合酶的酶活分析奠定了基础。
【学位授予单位】:吉林农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S567.219;Q943.2

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