收藏本站
《吉林农业大学》 2017年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

抗B型肉毒毒素轻链重组穿梭胞内抗体的研究

吉元刚  
【摘要】:肉毒毒素(BoNT)是由肉毒梭菌分泌的一类具有极强致死性外毒素,在国际上被归属为A类生物战剂。主要有A-H八种血清型,其中H型为新型报道的血清型,引起人类中毒的主要是A、B、E 3型为主。尽管肉毒梭菌所产生的神经毒素(A~H)在其免疫学特性、毒力和自然致病动物类型上各不相同,但是它们的结构及生化作用极为相似,毒素从结构上可分为2个相对分子量不同的蛋白分子,即Mr约为50KDa的无毒性血凝素(HA)和Mr约为15KDa的神经毒素活性。后者由多肽链所组成,是在严格意义上所讲的肉毒毒素。产生BoNT的肉毒梭菌生长繁殖所需的条件苛刻,可是产生BoNT所需的条件相对宽松。人类BoNT中毒绝大多数是由于食入或误食含有肉毒梭菌而产生毒素亦或是含有肉毒毒素的食物而引起。从近年流行趋势看,食源性和婴儿肉毒中毒呈逐年降低的态势,而创伤性肉毒中毒呈增多趋势。肉毒毒素由口腔、咽喉等上消化道吸收后进入小肠等消化吸收主要作用神经突触及神经末梢,抑制神经突触间的介质乙酰胆碱(Ach)的释放,使肌肉收缩运动障碍甚至软瘫。本课题以筛选的抗B型肉毒毒素轻链(BoNT/BL)的pIT2-ScFv基因为模板,PCR扩增ScFv基因,插入含有TAT的原核表达载体pET28a-TAT,PCR、双酶切及测序鉴定表明成功构建重组表达载体pET28a-TAT-ScFv,将其转化至感受态E.coliBL21(DE3)细胞中。添加IPTG于30℃诱导表达4 h后分析显示重组蛋白分子量约32kDa,蛋白主要以可溶性形式表达,优化诱导参数(培养基类型、诱导温度和时间)后进行高密度中试发酵。重组蛋白的纯化探索考虑其组氨酸标签与自身单链抗体的性质,将裂菌上清经chelating Sepharose Fast Flow(Cu2+)后,再经HiTrap Protein-A FF亲和层析柱精纯,得到高浓度高纯度的跨膜单链抗体蛋白(TAT-ScFv),检测纯化的TAT-ScFv中内毒素含量为0.1EU/ml,免疫印迹法对ScFv进行鉴定并检测其与BoNT/BL的免疫结合活性,结果显示明显的特异性免疫印迹条带,利用非竞争酶免疫法检测TAT-ScFv和毒素的亲和常数为(1.133±0.273)×106L/mol。制备特异性绿色荧光蛋白(GFP-SNAP25-VAMP),其中特异性添加的突触小泡膜蛋白(VAMP)为BoNT/BL作用底物,通过酶标仪检测荧光强度,判断BoNT/BL和TAT-ScFv活性,体外细胞实验培养小鼠成神经瘤细胞(N2a),通过检测乙酰胆碱(Ach)验证BoNT/BL抑制Ach释放和TAT-ScFv中和BoNT/BL的活性。采用小鼠动物模型试验证实BoNT/BL LD50约为1.627 ug/只,小鼠体内救治实验证实制备的TAT-ScFv对BoNT/BL具有免疫中和活性。
【学位授予单位】:吉林农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R99

【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 陈敏;扩大A型肉毒毒素应用的临床研究[J];国外医学.预防.诊断.治疗用生物制品分册;2000年02期
2 ;单次多水平肉毒毒素A治疗与外科治疗的异同[J];中国临床康复;2002年15期
3 陈敏;美国用A型肉毒毒素美容的宣传降温[J];国外医学.预防.诊断.治疗用生物制品分册;2003年01期
4 朱延红;路平;;A型肉毒毒素的临床应用[J];延安大学学报(医学科学版);2004年02期
5 赵丹;A型肉毒毒素临床新用途[J];现代中西医结合杂志;2005年15期
6 刘晓燕;肉毒毒素与美容偶联的应用与思考[J];中国实用美容整形外科杂志;2005年01期
7 宋宁静;;肉毒毒素美容疗法[J];皮肤病与性病;2006年01期
8 ;A型肉毒毒素临床应用新进展学习班通知[J];全科医学临床与教育;2006年05期
9 潘勇;韩岩;杨力;郭树忠;;B型肉毒毒素在美容领域的应用进展[J];中国美容整形外科杂志;2006年06期
10 许波;郭俊;程鹏远;;A型肉毒毒素在头痛治疗中的研究进展[J];国际神经病学神经外科学杂志;2007年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 李吉平;徐静;刘琳娜;孙玉成;刘文森;万家余;高宏伟;;高效液相色谱法检测肉毒毒素A方法的建立[A];中国畜牧兽医学会动物毒物学分会2009年学术研讨会论文集[C];2009年
2 赵辨;;肉毒毒素在美容皮肤病学中的应用[A];2002中国中西医结合皮肤性病学术会议论文汇编[C];2002年
3 万新华;Kevin Dat Vuong;Joseph Jankovic;;B型肉毒毒素治疗运动障碍病及多汗症的临床观察[A];中华医学会第七次全国神经病学学术会议论文汇编[C];2004年
4 卢振和;谢长春;高崇荣;;A型肉毒毒素注射治疗头痛初步观察[A];中华医学会疼痛学分会第六届年会论文摘要[C];2005年
5 程红;王莉波;蔺彬彬;张晶;;A型肉毒毒素不良反应的治疗与护理[A];中国美容与整形医师大会论文汇编[C];2005年
6 燕铁斌;;A型肉毒毒素临床应用及操作流程[A];2011年浙江省物理医学与康复学学术年会暨康复新进展学习班论文汇编[C];2011年
7 兰月;窦祖林;胡昔权;丘卫红;;A型肉毒毒素对脑损伤后痉挛上肢的治疗应用[A];中华医学会第八次全国物理医学与康复学学术会议论文汇编[C];2006年
8 窦祖林;燕铁斌;;不同定位方法下的肉毒毒素注射[A];广东省康复医学会、广东社会学会健康研究专业委员会2007年学术年会论文汇编[C];2007年
9 董桂霞;;眼科患者对A型肉毒毒素注射认知情况调查及护理对策[A];中华护理学会全国肿瘤护理新进展研讨会论文汇编[C];2012年
10 凌影;梁坚;喻冰菲;林泉;梁杨;;A型肉毒毒素治疗咬肌肥大的疗效观察[A];第七届中国医师协会美容与整形医师大会论文集[C];2010年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 本报记者 钟可芬;A型肉毒毒素监管收紧[N];医药经济报;2008年
2 王荫椿 韩义贞;A型肉毒毒素可治50余种病症[N];健康报;2002年
3 记者 郭兆锋;国产肉毒毒素不向美容机构出售[N];中国消费者报;2006年
4 王丹;A型肉毒毒素列入毒性药品管理[N];大众卫生报;2008年
5 记者 任丽梅;我国将A型肉毒毒素列入毒性药品管理[N];中国改革报;2008年
6 王丹;A型肉毒毒素列入毒性药品管理[N];健康报;2008年
7 湘雅二医院神经内科 段小娟;浅谈A型肉毒毒素[N];大众卫生报;2002年
8 湖北省天门市第一人民医院神经内科主任医师 杨小华;肉毒毒素也可治疗肌肉痉挛[N];健康报;2013年
9 徐铮奎;肉毒毒素治疗中风后遗症[N];中国医药报;2004年
10 供稿/《走近医学》;肉毒毒素除皱危险大[N];北京科技报;2004年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 段晨旺;A型肉毒毒素在肌皮瓣扩张中的应用[D];中国协和医科大学;2009年
2 杨雄;A型肉毒毒素治疗良性前列腺增生症的实验研究[D];华中科技大学;2011年
3 刘玉生;肌内注射曲安奈德及肉毒毒素诱导兔咬肌萎缩试验及临床研究[D];第一军医大学;2006年
4 鲍世威;A型肉毒毒素在额部皮肤软组织扩张中的应用[D];中国协和医科大学;2008年
5 史晶;肉毒毒素与蛋白受体相互作用的分子基础及其应用的研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2007年
6 杨秀清;抗B型肉毒毒素鼠源中和抗体快速制备及其免疫学活性的初步研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2005年
7 温静;内镜下注射A型肉毒毒素对内镜下粘膜剥离术后食管狭窄的预防与治疗[D];中国人民解放军医学院;2014年
8 刘建军;A型肉毒毒素治疗脑瘫儿童痉挛的最佳剂量选择研究[D];首都医科大学;2007年
9 于蕊;A型肉毒毒素人源性中和抗体的制备[D];中国人民解放军军事医学科学院;2008年
10 周晓东;A型肉毒毒素化学去神经及传统手术去神经比较,肌肉游离移植为主的方法综合治疗面瘫的基础及临床应用研究A型肉毒毒素面肌痉挛治疗临床应用[D];中国协和医科大学;2004年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 俞力夫;A型肉毒毒素注射对上中面部年轻化作用的临床研究[D];昆明医科大学;2015年
2 李玉洁;B型肉毒毒素轻链蛋白特异性抗体的筛选及其活性测定[D];吉林农业大学;2015年
3 韦耀;A型肉毒毒素(BoNT/A)表位多肽单克隆抗体的制备及其效价评定[D];南方医科大学;2013年
4 黄金东;A型肉毒毒素治疗病理性瘢痕的临床疗效观察[D];广州中医药大学;2016年
5 陈玲;A型肉毒毒素治疗HFS、BS、Meige综合征的疗效及影响因素的分析[D];昆明医科大学;2016年
6 薛光泽;A型肉毒毒素对大鼠超长轴型皮瓣成活影响的实验研究[D];北京协和医学院;2015年
7 孙婷婷;A型肉毒毒素联合应用硅凝胶抑制内眦赘皮矫正术后瘢痕的观察[D];大连医科大学;2016年
8 张诗若;A型肉毒毒素咬肌注射联合透明质酸填充剂隆下颏重塑下1/3面部轮廓的临床观察[D];大连医科大学;2017年
9 黄烨华;A型肉毒毒素注射美容精益化治疗的临床满意度分析[D];大连医科大学;2017年
10 MOHAMMAD NASB;A型肉毒毒素注射联合改良强制性运动疗法与联合高强度传统康复治疗对脑卒中后上肢运动功能的疗效对比[D];吉林大学;2017年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026