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《吉林农业大学》 2017年
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亚麻芥油体提取工艺的建立及转bFGF基因油体冻干粉配方的优化

高红桃  
【摘要】:油体是植物种子内储藏脂肪的亚细胞单位,其内部为三酰甘油(TAG),外部由单层磷脂和油体蛋白组成。这种稳定的结构可以使油体抵抗环境的压力,便于应用到食品及制药工业中。碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblast growthfactor,bFGF)是成纤维细胞生长因子(FGFs)家族23个成员中的一员,是一种作用广泛的细胞因子,FGF的功能现在研究最多的是其最显著的生物作用:促进细胞增殖分裂。同时,它还参与肿瘤的发生发展、促进损伤组织的修复、促血管生成作用,从而备受关注。在前人基础上,本实验室已经成功获得转bFGF基因亚麻芥种子,首先针对野生型亚麻芥种子油体提取工艺进行摸索,运用到转bFGF基因亚麻芥种子油体提取中去,对转bFGF基因亚麻芥种子油体生物活性做进一步研究。同时,为了研究转bFGF基因亚麻芥种子油体的稳定性,本研究考察了在冻干粉中影响转bFGF基因亚麻芥种子油体稳定性的因素,确定转bFGF基因亚麻芥种子油体冻干粉的最佳配方。本研究运用统计学和实验验证相结合的手段,对转bFGF基因亚麻芥种子油体的提取、工艺优化、定量分析、生物活性验证及稳定性进行研究。得到结论主要如下:1.本研究首次对亚麻芥种子油体提取方法进行了研究,对比碱法、水法、Tris-HCl法、Tricine法四种油体提取方法,利用梯度离心的手段,制备亚麻芥油体。并且通过显微镜及激光粒度仪对亚麻芥种子中油体的结构及大小进行分析,采用SDS-PAGE对逐步清洗纯化的亚麻芥油体电泳检测,确定杂蛋白的清除效果。结果表明,四种方法所提取的油体大小均在0.5-1μm之间;相较于水法、Tricine法,碱法所回收油体被破坏,Tris-HCl法提取油体大小均一,提取率达17%。确定Tris-HCl法为油体提取最佳的方法。2.针对该提取方法中可能涉及到的对提取油体有所影响的相关因素进行摸索研究,确定Suroce:0.4 mol/L、料液比1:25;缓冲液pH值8.0;为最佳油体提取工艺,可获油体提取率为34%,油体大小在150-200 nm之间,且稳定、均匀分散。3.利用Western Blot法对转bFGF基因亚麻芥油体融合蛋白进行定量分析,可得oleosion-bFGF的表达量为3.19±1.59μg/μl,在种子中的表达量为0.85±0.13mg/g,油体纯化成本大概5-20元/克,与原核表达系统相比较来说大大降低了生产成本。4.本研究以含有bFGF的油体为主要研究对象,以野生型油体为阴性组,市售bFGF标品为阳性组,研究转bFGF基因亚麻芥油体对NIH/3T3细胞的促增值活性。MTT体外增殖实验表明,转bFGF基因亚麻芥油体对NIH/3T3细胞具有显著的促增殖作用。5.通过以冻干粉形式储存油体,对转bFGF基因亚麻芥油体冻干粉配方进行筛选。以NIH/3T3细胞的增值率为主要指标,成功筛选出总蛋白量20 mg为冻干粉中油体最佳添加量、以10%的甘露醇为转bFGF基因亚麻芥油体的保护剂、PBS(pH=8)液体溶解油体,作为转bFGF基因亚麻芥油体冻干粉的最佳配方,为进一步研究转bFGF基因亚麻芥油体的稳定性及产品开发奠定了基础。
【学位授予单位】:吉林农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:TQ644.2

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