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《吉林农业大学》 2017年
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FGF5基因敲除辽宁绒山羊胎儿成纤维细胞系的构建

曾晓晨  
【摘要】:成纤维细胞生长因子5(Fibroblast growth factors 5,FGF5)是影响毛囊周期性生长的重要生长因子。本研究利用CRISPR/Cas9系统对辽宁绒山羊FGF5基因进行敲除,为深入研究FGF5的功能奠定基础。根据Genebank中已发表山羊FGF5(KC236981.1)基因编码区的序列信息设计引物,扩增出辽宁绒山羊FGF5基因的完整CDs区(Coding sequence)813bp,测序结果并未发现其剪接体FGF5s。FGF5基因中CDs区共编码270个氨基酸,理论分子质量为29.55kDa,理论等电位点为10.59,为亲水性蛋白,有信号肽,属于分泌蛋白,经序列对比分析其与牛的同源性为97.2%。采用组织块贴壁法分离辽宁绒山羊胎儿成纤维细胞,对其进行性别鉴定、生长曲线与核型分析,选出生长旺盛和核型正常的胎儿成纤维细胞用于后续研究。结果显示,成功建立了辽宁绒山羊胎儿成纤维细胞的体外培养体系,细胞系S1为雌性,S2为雄性,其生长旺盛,状态良好,核型正常,有30对染色体。利用生物学软件,针对绒山羊FGF5基因第一外显子,设计5个预测的sgRNA靶位点。构建CRISPR/Cas9重组载体,分别为PX459-FGF5-l、PX459-FGF5-2、PX459-FGF5-3、PX459-FGF5-4和PX459-FGF5-5,经测序表明载体连接成功。采用脂质体3000介导5个PX459-FGF5载体分别转染辽宁绒山羊胎儿成纤维细胞,经过T7EI酶酶切检测靶序列的有效性,选出敲除效率好载体转染的细胞,单克隆细胞扩繁培养,再提取基因组,脱靶检测,PCR及克隆测序验证。结果表明,有2个PX459-FGF5载体成功地进行了特异性切割和突变。随机选取60个单克隆细胞,测序获得23株辽宁绒山羊成纤维转基因细胞系(包括缺失插入和替换),均在靶位点发生FGF5突变,总突变率为38.3%。其中有9株发生插入缺失的单克隆细胞系适于作为体细胞核移植的供体细胞,为高产绒量辽宁绒山羊新品种的培育奠定了基础。
【学位授予单位】:吉林农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S827

【参考文献】
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