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《吉林农业大学》 2017年
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新型沙门菌载体递送A型产气荚膜梭菌PlcC、NetB及Fba抗原的初步研究

曾庆丰  
【摘要】:产气荚膜梭菌广泛存在于环境及动物的胃肠道部位,一定条件下,可以成为致病菌,给畜牧业造成巨大的危害和损失。因其菌株类型比较多,产生毒素种类比较丰富,所以控制其有效的方法就是运用疫苗来预防它造成疾病的感染。延迟裂解型沙门菌系统作为一种新型外源蛋白表达体系,一方面在免疫动物后,可以确保质粒载体在体内编码保护性抗原的稳定性,同时选用阿拉伯糖(arabinose,Ara)作为筛选标记,避免了耐药标记的应用,对环境无害,另一方面是通过口服方式摆脱了针剂带来的成本和安全问题,方法简便安全,是一种比较理想的疫苗载体。α毒素C末端(plcC)和NetB毒素作为产气荚膜梭菌毒素的重要组成部分,已被证实具有良好的免疫原性。Fba是产气荚膜梭菌分泌的一种代谢酶,称为二磷酸果糖酶,推测Fba对于产气荚膜梭菌的毒素的产生有至关重要的作用,因此其本身也是一种潜在的抗原蛋白。本试验选用延迟裂解型沙门菌作为抗原递送载体,构建了表达Fba蛋白的重组沙门菌,进而构建了同时表达plcC、NetB和Fba三种抗原的新型重组沙门菌,并对它们的免疫效果进行分析和评价。本试验研究内容及结果如下:(1)A型产气荚膜梭菌Fba蛋白的纯化及血清特异性Fba多抗的制备本研究首先由生物公司合成A型产气荚膜梭菌Fba基因序列,利用PCR技术扩增带Fba基因并将其克隆到表达载体pET-30a中,获得pET-30a-Fba重组质粒。再将重组质粒转化到BL21感受态细胞中,在卡那霉素的筛选压力下,获得阳性转化子BL21(pET-30a-Fba),并经过IPTG诱导表达His-Fba蛋白,通过His-tag Ni柱亲和层析纯化后,回收较高浓度的His-Fba蛋白,免疫新西兰大白兔制备血清特异性Fba多抗。(2)pYA3681-Fba、pYA3681-plcC-NetB-Fba两个重组质粒的构建及抗原在χ11802中的表达。通过基因工程方法构建重组质粒pYA3681-Fba和pYA3681-plcC-NetB-Fba,并转化到大肠杆菌χ6212感受态中,使其能稳定表达抗原,再将能稳定复制的重组质粒转化到χ11802感受态中,重组菌χ11802(pYA3681-Fba)和χ11802(pYA3681-plcC-NetB-Fba)经IPTG诱导后表达蛋白,通过Western blotting检测表达蛋白的免疫反应原性。实验结果表明:成功构建了χ11802(pYA3681-Fba)和χ11802(pYA3681-plcC-NetB-Fba)延迟裂解型沙门菌,Western blotting验证表达蛋白的免疫反应原性良好,为下一步进行延迟裂解型沙门菌免疫动物以及攻菌实验奠定基础。(3)χ11802(pYA3681-Fba)和χ11802(pYA3681-plcC-NetB-Fba)延迟裂解型沙门菌免疫保护效果的研究按免疫程序将χ11802(pYA3681-Fba)和χ11802(pYA3681-plcC-NetB-Fba)延迟裂解型沙门菌通过口服方式喂饲小鼠。三免疫结束后的一周,用间接ELISA方法检测小鼠体内LPS、plcC、NetB及Fba特异性Ig G和SIg A的含量,ELISA试剂盒检测小鼠血清内细胞因子的分泌情况。流式细胞术检测各免疫器官中T淋巴细胞,B淋巴细胞以及DC细胞的活化情况。攻菌后监测小鼠体重,计算体重丢失率及存活率,并对小鼠小肠做病理切片,分析小肠病理损伤的变化。试验结果显示:χ11802(pYA3681-Fba)和χ11802(pYA3681-plcC-NetB-Fba)延迟裂解沙门菌可以有效地提高小鼠体内特异性Ig G和SIg A的水平。攻菌后新型延迟裂解沙门菌组小鼠体重丢失较少且恢复较快,存活率也明显高于其它对照组,χ11802(pYA3681-Fba)组存活率为20%,χ11802(pYA3681-plcC-NetB-Fba)组存活率为40%,并且小肠绒毛的完整性高于对照组,且三抗原共表达重组菌免疫效果更佳。综上所述:χ11802(pYA3681-Fba)和χ11802(pYA3681-plcC-NetB-Fba)延迟裂解型沙门菌构建并表达成功。重组沙门菌能有效刺激小鼠上调脾脏和肠系膜淋巴结中CD11C~+CD83~+比例,上调脾脏中CD3~+CD4~+IL-4~+和CD3~+CD4~+IFNγ~+比例,上调肠系膜淋巴结中B220~+Ig A~+的比例。同时刺激小鼠产生特异性Ig G和s Ig A抗体,上调小鼠IL-4和IFN-γ细胞因子,为产气荚膜梭菌新型口服疫苗制剂的研制成功奠定基础。
【学位授予单位】:吉林农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.61

【参考文献】
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【共引文献】
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