收藏本站
《吉林农业大学》 2017年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

新孢子虫病原分离鉴定及免疫化学检测方法的建立

王琪  
【摘要】:新孢子虫病(Neosporosis)是一种原虫病,它是由犬新孢子虫(Neospora caninum)寄生在多种动物体内引起的,该病会引起家畜的死亡。犬新孢子虫是一种原生性寄生虫,其宿主种类繁多,如今已经证明犬科动物是新孢子虫的终末宿主,其中间宿主范围非常广泛,如牛、马、羊、梅花鹿、野牛、猪、豚鼠、沙鼠、家猫等均可感染。宿主的多种细胞和组织脏器内均有虫体的寄生;该病会造成孕畜流产和死胎等,给畜牧业造成巨大经济损失,且目前无特效的药物及疫苗来治疗和预防该病,因此,快速诊断出患病动物、对病畜实施隔离和淘汰仍然是消灭、防控本病的最具有成效的办法。目前,国内外学者针对新孢子虫检测技术已经做了很多研究,本研究通过人工感染试验动物,采用Vero细胞从感染动物的脑组织分离新孢子虫的检测方法,利用HE染色观察病理变化;同时建立免疫组化和间接免疫荧光方法来检测新孢子虫病。1、本研究建立新孢子虫细胞病原分离方法。首先将疑似因感染新孢子虫而流产的牛胎儿脑组织匀浆,接种到培养好的均匀生长的单层Vero细胞中,同时腹腔注射接种到大鼠体内,每天在显微镜下观察细胞状态,同时观察大鼠的精神状态和临床症状。接种细胞后在显微镜下可见弯月形虫体,提取细胞中虫体DNA和出现症状的大鼠主要实质器官的DNA,用根据GenBank中登录的NcSRS2基因设计合成的引物进行扩增,并测序,结果显示同源性为99%,成功分离到新孢子虫。2、为了更好地观察宿主感染新孢子虫后的临床症状及各组织脏器的损伤程度,将虫体大量增殖,收集并纯化虫体,腹腔注射人工感染大鼠,对其出现的临床症状进行观察,同时取各组织器官制作石蜡切片并用HE染色方法对其进行染色,观察各组织器官的损伤程度。大鼠接种新孢子虫3d后精神萎靡,食欲下降,前期饮欲增强,随后出现见人恐惧,将身体蜷缩成一团的症状,进而饮欲也下降,后期很少进食。剖检可见肾脏肿胀,脑膜充血,肺脏上有红色的病灶。取各组织脏器制作石蜡切片经HE染色观察其病理变化,可见各脏器广泛出血,心肌纤维坏死,心肌细胞排列紊乱;肝细胞索排列紊乱,肝细胞核边缘化,肝细胞肿大;脾窦充血,中央动脉管壁增厚;肺泡间质增宽,形态逐渐消失,有大量炎性细胞浸润;肾小球形态逐步消失,肾淤血,肾小管萎缩;脑神经元肿胀变性,脑组织出血。3、建立免疫组织化学方法检测新孢子虫。本研究通过对一抗、二抗的工作浓度、孵育时间和抗原的修复方式等条件进行优化,成功建立了新孢子虫的免疫组织化学检测方法,当一抗进行400倍稀释,二抗进行100倍稀释时,效果最好,背景染色浅,阳性细胞染色深,用该方法可以在感染的大鼠的脑组织中检测到包囊。对人工感染弓形虫和牛双芽巴贝斯虫的大鼠的脑组织进行免疫组化检测,未检测到包囊,结果呈阴性,证明该方法具有较好的特异性。4、将新孢子虫速殖子作为已知抗原,对抗体的工作浓度进行优化筛选,在一抗400倍稀释、荧光素标记的二抗200倍稀释时,非特异性荧光最弱,虫体形态最清晰,发出较亮的荧光呈黄绿色,成功建立了间接免疫荧光方法用于新孢子虫的检测。用建立的方法对弓形虫和牛双芽巴贝斯虫的标准阳性血清实施检测,结果呈阴性,无荧光,表明此方法具有较好的特异性;从中随机抽取血清进行3次重复性检测,3次检测结果没有明显的差异,表明该方法具有较好的重复性和稳定性。用建立的方法检测从吉林省多个牛场采集的236份血清样本,有38份血清样本呈阳性,阳性率为16.1%。
【学位授予单位】:吉林农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.7

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 艾力江·排力丁;吉尔格力;库尔班·艾山;依马木·阿布力克木;巴音查汗;;巴州部分地区黑头羊新孢子虫病的循环抗体检测[J];新疆畜牧业;2014年09期
2 范晴;谢芝勋;刘加波;庞耀珊;邓显文;谢志勤;谢丽基;彭宜;;牛病毒性腹泻二温式PCR检测方法的建立[J];中国奶牛;2010年10期
3 金超;贾立军;曹世诺;栾杨;王娜;李月梅;张守发;;牛新孢子虫病LAMP检测方法的建立[J];中国兽医科学;2009年12期
4 邓冲;张维;刘群;刘晶;丁隽;;Balb/c小鼠新孢子虫病动物模型的建立及在其体内发育过程的研究[J];中国农业科学;2009年03期
5 翟延庆;李利;王春仁;;新孢子虫NcSRS2基因的克隆和亚克隆[J];黑龙江畜牧兽医;2008年04期
6 高建伟;鲁承;孙婷婷;;急性新孢子虫病沙鼠动物模型的建立[J];延边大学农学学报;2008年01期
7 于晋海;刘群;夏兆飞;;牛新孢子虫病和弓形虫病的流行病学调查[J];中国兽医科学;2006年03期
8 罗洪林,黄维义;新孢子虫病的研究进展[J];广东畜牧兽医科技;2004年01期
9 刘群,李博,齐长明,朱引洁;奶牛新孢子虫病血清学检测初报[J];中国兽医杂志;2003年02期
10 陶生策,张治平,张先恩;PCR技术研究进展[J];生物工程进展;2001年04期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 杨升;刘维建;宫鹏涛;李建华;杨举;李赫;张西臣;;牛新孢子虫感染胶体金检测方法的建立[J];中国病原生物学杂志;2017年10期
2 贺鹏飞;翟涛;宫鹏涛;张西臣;李建华;;长春市周边草原黄牛新孢子虫感染检测结果分析[J];中国预防医学杂志;2017年11期
3 康晓冬;高海慧;脱征军;邵怀峰;张和平;马振明;孙文华;温万;;宁夏地区奶牛新孢子虫病的流行病学调查[J];中国畜牧兽医文摘;2017年09期
4 吉尔格力;许正茂;刘梦丽;乔格拉森;巴音查汗;;巴州部分地区牦牛黄牛新孢子虫病循环抗体检测[J];中国兽医杂志;2017年08期
5 伊平昌;李国平;;青海大通牛新孢子虫病血清学调查[J];中国兽医杂志;2017年05期
6 王军;皇甫和平;石冬梅;王岩;林松涛;杜营彬;田林涛;;河南省部分奶牛场新孢子虫血清抗体检测[J];中国兽医杂志;2017年05期
7 李小璟;龚双燕;陈瑛琪;李雨濛;蔡瑶;徐逸飞;朱玲;徐志文;;猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪流行性腹泻病毒双重RT-PCR检测方法的建立与应用[J];中国兽医科学;2017年05期
8 张贺洋;刘晋宇;凌芳芳;兰岚;姜利建;贾立军;;吉林省牛新孢子虫病流行病学调查[J];中国兽医杂志;2017年03期
9 李忠;赵燕;李杰;宋权儒;李知新;;宁夏规模场奶牛新孢子虫病血清学调查[J];甘肃畜牧兽医;2017年02期
10 张赟;周国丽;杨冉;刘慧敏;杨国庆;;高G-C含量突变型Foxo1转基因动物基因型鉴定PCR方法的建立[J];河南科学;2017年02期
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 张宁;赵博伟;胡晓悦;张军;刘晓慧;王学会;;牛新孢子虫病最新研究进展[J];上海畜牧兽医通讯;2013年01期
2 杨帆;王莲芳;陈亮;巴音查汗;;新孢子虫病P43蛋白质(包涵体)的纯化及rELISA方法的建立[J];新疆农业大学学报;2010年04期
3 邓显文;谢芝勋;谢丽基;刘加波;谢志勤;庞耀珊;余晓丽;;二温式聚合酶链反应鉴别诊断迟缓爱德华氏菌病[J];水生态学杂志;2009年02期
4 王春仁;李志莲;翟延庆;倪宏波;陈爱华;陈佳;王宇;;奶牛新孢子虫重组蛋白NcSRS2t间接ELISA方法的建立及初步应用[J];中国预防兽医学报;2009年02期
5 王常汉;巴音查汗;王振宝;;新孢子虫病研究进展[J];草食家畜;2008年02期
6 范进江;薄新文;钟发刚;;牛病毒性腹泻病毒基因组结构与蛋白功能研究进展[J];动物医学进展;2008年05期
7 丁德;梁晚枫;田野;田万年;贾立军;张守发;;犬新孢子虫NcSRS2基因原核表达质粒的构建[J];动物医学进展;2008年02期
8 庞耀珊;谢芝勋;邓显文;唐小飞;刘加波;;二温式PCR检测对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒的研究[J];水利渔业;2007年01期
9 马利青;王戈平;李晓卉;陆艳;马少丽;;青海省海西地区山羊和绵羊犬新孢子虫病的血清学调查[J];家畜生态学报;2007年01期
10 肖海霞;陈静波;海丽且木;祁志平;;应用PCR法和LAMP法鉴定牛早期胚胎性别的研究[J];新疆农业大学学报;2006年04期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 孟祥庆 ,李树珩;蜂群孢子虫病的防治[J];四川畜牧兽医;2002年12期
2 王世玉 ,李树珩;注意防治蜂群孢子虫病[J];养蜂科技;2003年03期
3 马利青;;犬新孢子虫和新孢子虫病的综述[J];青海畜牧兽医杂志;2006年02期
4 蔡光烈;鲁承;高春生;张夏平;吴丹;;吉林省牛新孢子虫病的流行病学调查[J];延边大学农学学报;2006年02期
5 赵占中;刘群;赖志;龚建培;;新孢子虫疫苗的研制概况[J];上海畜牧兽医通讯;2006年03期
6 李高山;;阿弗菌素治愈鲫鱼孢子虫病实例[J];科学养鱼;2006年10期
7 孔琳;鞠玉琳;;七种中药体外抗新孢子虫效果的比较研究[J];黑龙江畜牧兽医;2008年10期
8 张洁;丰雪;;春季养蜂严防孢子虫病[J];新农村;2009年01期
9 张兴绵;;防治孢子虫病的几点体会[J];中国蜂业;2009年04期
10 叶建生;;鲫鱼孢子虫病防治技术[J];渔业致富指南;2009年13期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 杨娜;郝攀;刘群;;(犬)新孢子虫牛源北京株的分离与鉴定[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十一次学术研讨会论文集[C];2011年
2 张维;于珊珊;杨道玉;刘群;;新孢子虫胶体金免疫层析检测方法的建立及初步应用[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十一次学术研讨会论文集[C];2011年
3 米俊宪;钟友刚;施振声;;犬新孢子虫[A];中国畜牧兽医学会养犬学分会第十二次全国养犬学术研讨会论文集[C];2007年
4 马利青;廖敏;Hiroshi Suzuki;玄学南;;犬新孢子虫二硫氢键异构酶蛋白的表达、克隆和鉴定[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会论文集[C];2008年
5 张维;刘晶;刘群;姚雷;胡月凤;杨娜;;牛群中新孢子虫病传播途径的初步研究[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十次学术研讨会论文集[C];2009年
6 遇秀玲;陈南华;胡冬梅;张维;李晓霞;汪宝玥;康立平;李向东;刘群;田克恭;;中国养殖蓝狐(北极狐)幼狐中新孢子虫病的鉴定[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十次学术研讨会论文集[C];2009年
7 张维;邓冲;遇秀玲;卢计委;刘晶;刘群;;新孢子虫的分离与鉴定[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第九次学术研讨会论文摘要集[C];2006年
8 刘晶;余劲术;张维;邓冲;丁隽;汪明;刘群;;新孢子虫重组NcSAG1-SRS2蛋白间接ELISA方法的建立及牛新孢子虫病流行病学的初步调查[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第九次学术研讨会论文摘要集[C];2006年
9 陈亮;闫双;巴音查汗;;新孢子虫病rELISA抗体检测方法的建立及应用[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十一次学术研讨会论文集[C];2011年
10 姚雷;杨娜;张维;钱伟峰;胡月凤;丁隽;刘群;;巢式PCR检测奶牛流产胎儿体内的新孢子虫[A];中国畜牧兽医学会2008年学术年会暨第六届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集[C];2008年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 湖北远安县农技中心 杨玉凤 李小玲 刘剑霞 胡枭;鲤鱼孢子虫病防治新法[N];河北科技报;2006年
2 大富;防治蜂群孢子虫病[N];新疆科技报(汉);2007年
3 丁丽萍;蜂群防治孢子虫病[N];云南科技报;2007年
4 ;蜂群怎样防治孢子虫病[N];中国畜牧兽医报;2008年
5 李小波;庄稼医院[N];山西科技报;2004年
6 记者 牛金辉;我区科研人员发明新孢子虫病抗体检测试剂盒[N];新疆科技报(汉);2012年
7 曾令兵;伊维菌素防治孢子虫[N];中国渔业报;2013年
8 吴桂亮;黑鱼孢子虫病防治方法[N];江苏农业科技报;2007年
9 繁德 孔维真;三项行标填补国内空白[N];中国国门时报;2010年
10 杨国义 张晋新;蜜蜂常见病虫害的安全防治[N];山西科技报;2004年
中国博士学位论文全文数据库 前8条
1 马磊;新孢子虫ROP5和ROP16的功能及作用机制[D];中国农业大学;2017年
2 贺鹏飞;犬新孢子虫特异基因筛选、检测方法建立及应用[D];吉林大学;2013年
3 吕强;犬新孢子虫宿主细胞结合蛋白筛选及其免疫原性分析[D];吉林大学;2013年
4 冯晓声;诱发TH-1型免疫应答的犬新孢子虫可溶性复合物的探寻及机理研究[D];吉林大学;2010年
5 曹利利;犬新孢子虫“警报素”介导的宿主Th1型免疫应答的研究[D];吉林大学;2010年
6 雷涛;棒状体蛋白18介导弓形虫和新孢子虫毒力差异的分子机制研究[D];中国农业大学;2014年
7 李文生;新孢子虫MIC6的鉴定、功能及其作用机制的初步研究[D];中国农业大学;2015年
8 田来明;梅花鹿感染犬新孢子虫双抗夹心Dot-ELISA检测方法的建立及应用[D];吉林大学;2015年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 董鹏;吉林省部分地区牛布氏杆菌病和新孢子虫病的流行病学调查[D];延边大学;2015年
2 马莉;犬新孢子虫对BABL/c小鼠胎盘相关激素水平的影响[D];延边大学;2015年
3 翟凯;洛阳地区奶牛流产主要病原的检测与分析[D];河南科技大学;2015年
4 杨东升;新孢子虫NcMIC2-like1重组蛋白对小鼠新孢子虫感染的免疫保护作用[D];吉林大学;2016年
5 陈千林;新孢子虫病和弓形虫病TaqMan-MGB定量荧光PCR检测方法的建立及初步应用研究[D];新疆农业大学;2016年
6 和学秀;BALB/c小鼠感染新孢子虫后腹腔巨噬细胞极化的初步研究[D];吉林大学;2017年
7 翟涛;表观遗传学修饰对新孢子虫感染的小鼠巨噬细胞IL-12延迟表达的调控[D];吉林大学;2017年
8 王琪;新孢子虫病原分离鉴定及免疫化学检测方法的建立[D];吉林农业大学;2017年
9 牛国辉;牛新孢子虫病分子检测技术的研究[D];新疆大学;2010年
10 蔡光烈;牛新孢子虫病间接荧光抗体诊断方法的建立及流行病学调查[D];延边大学;2006年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026